CUL4B細(xì)胞周期候選靶蛋白的分析.pdf

1、細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程。在進(jìn)化過程中，細(xì)胞建立并發(fā)展了一系列的調(diào)控機(jī)制，以確保細(xì)胞周期嚴(yán)格有序地交替和各個(gè)時(shí)相依次有序變更。多種細(xì)胞周期蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用，其主要包括：細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）家族蛋白、細(xì)胞周期蛋白（cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）。細(xì)胞通過對三類細(xì)胞周期蛋白的合成、降解以及翻譯后修飾等環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控，從而保

2、證細(xì)胞周期正常的進(jìn)行。
　　 泛素依賴的蛋白質(zhì)降解是細(xì)胞調(diào)控蛋白質(zhì)活性的一個(gè)基本機(jī)制，在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要的作用，幾乎所有細(xì)胞周期蛋白的降解都依賴于該過程。CUL4B屬于cullin蛋白家族，該家族成員是泛素依賴降解系統(tǒng)中E3連接酶的成員，在本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的CUL4B突變導(dǎo)致精神發(fā)育遲滯的家系中，女性攜帶者出現(xiàn)X染色體失活偏倚，患者骨骼發(fā)育異常以及CUL4B低表達(dá)的細(xì)胞出現(xiàn)S期停滯提示CUL4B可能在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用

3、。然而，目前對于CUL4B在細(xì)胞周期調(diào)控方面的研究還比較少，僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的靶蛋白（如Cyclin E、CDT1和p21），因此尋找CUL4B在細(xì)胞周期調(diào)控過程中的蛋白對研究CUL4B在細(xì)胞周期調(diào)控中的生物學(xué)功能至關(guān)重要。
　　 首先，我們提取穩(wěn)篩的CUL4B低表達(dá)非同步化的HeLa和HEK293細(xì)胞及其對照細(xì)胞的總蛋白，利用western blotting分析方法對p21、p27、p53、CDT1、CDC6、

4、cyclin D1、CHK1、E2F1、CDC25A、CDC25C和CDK2等細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組和對照組沒有顯著的差異。
　　 隨后我們通過向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞周期阻斷藥物的方法將CUL4B低表達(dá)的HeLa和HEK293細(xì)胞及其對照細(xì)胞分別同步化至G1期、S期、G2/M期，并使用流式細(xì)胞術(shù)對同步化效果進(jìn)行監(jiān)控。確定合適的處理方法后，我們提取同步化至不同時(shí)期的CUL4B低表達(dá)HeLa和

5、HEK293細(xì)胞及其對照細(xì)胞的總蛋白，同樣使用western blotting分析檢測上述蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，CUL4B低表達(dá)的HeLa細(xì)胞內(nèi)p53、p27和CHK1蛋白在S期有明顯的積累。然而在CUIAB低表達(dá)的HEK293細(xì)胞中p53在G1/S期積累，CHK1在S期積累，p27沒有明顯的變化。為了明確導(dǎo)致CUL4B低表達(dá)HeLa細(xì)胞內(nèi)p27、p53和CHK1蛋白積累的分子機(jī)制，我們又檢測了上述基因在S期時(shí)的mRN

6、A的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUL4B低表達(dá)的細(xì)胞中上述基因的mRNA水平與對照細(xì)胞相比并沒有明顯的差異，提示這些蛋白在S期內(nèi)CUIAB低表達(dá)HeLa細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄后水平而非轉(zhuǎn)錄水平。對這幾種蛋白半衰期的測定發(fā)現(xiàn)在CUL4B低表達(dá)的HeLa細(xì)胞中p27和CHK1的半衰期明顯延長，表明CUL4B的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致這兩種蛋白的降解發(fā)生障礙。隨后我們發(fā)現(xiàn)外源性CUIAB的表達(dá)能夠減輕因內(nèi)源性CUIAB表達(dá)下調(diào)而造成的p27、p53和CHK1的