CUL4B通過抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老.pdf

1、p53是重要的抑癌基因，50％以上的人類腫瘤中該基因存在突變，并且純合敲除p53的小鼠可自發(fā)多種腫瘤。該基因編碼的蛋白半衰期很短，使該蛋白維持較低的表達(dá)水平，多種壓力刺激均可激活p53，使該蛋白半衰期延長(zhǎng)?；钚匝?ROS)是細(xì)胞有氧代謝所產(chǎn)生的一類含氧化合物的總稱，包括羥自由基(.OH)、超氧陰離子(O2.-)、過氧化氫(H2O2)以及其他多種過氧化物。ROS可作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的第二信使，參與調(diào)控多種細(xì)胞生理過程。
　　抑癌基因p

2、53可以調(diào)控ROS水平。生理?xiàng)l件或短暫輕度的壓力刺激下，p53可緩解氧化壓力發(fā)揮抗氧化作用，而較強(qiáng)和持續(xù)的壓力刺激下p53將加劇氧化壓力發(fā)揮促氧化作用。p53發(fā)揮抗氧化或是促氧化作用的機(jī)制主要是通過調(diào)控其下游氧化還原相關(guān)基因。CDKN lA，PIG3，PUMA，BAX，GPX1等一系列p53靶基因均可在一定壓力刺激下調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　E3泛素連接酶復(fù)合物的骨架蛋白CUL4B在多種生物進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，包括細(xì)胞周期，

3、DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。CUL4B在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并具有明顯的促癌作用。但其對(duì)細(xì)胞衰老的影響尚不清楚。強(qiáng)烈壓力刺激后衰老和凋亡是細(xì)胞的兩種重要命運(yùn)走向。而這種走向在不同的細(xì)胞中往往存在傾向性，例如宮頸癌細(xì)胞HeLa，人類腎上皮細(xì)胞HEK293等往往容易走向凋亡而人類成骨肉瘤細(xì)胞U2OS和正常人類成纖維細(xì)胞NHF則更容易走向衰老。為了探討CUL4B在細(xì)胞衰老中發(fā)揮的作用，我們利用人類成骨肉瘤細(xì)胞U2OS和正常人類成纖維細(xì)胞NHF進(jìn)行了實(shí)

4、驗(yàn)研究。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中存在蛋白水平的顯著下調(diào)并且這種下調(diào)促進(jìn)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老進(jìn)程。
　　p53可調(diào)控細(xì)胞活性氧水平，而細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的改變同樣可影響p53的激活，提示細(xì)胞內(nèi)可能存在p53-ROS反饋環(huán)。較強(qiáng)或持續(xù)壓力刺激下p53發(fā)揮促氧化作用，p53激活后可通過影響CDKN lA，PIG3等一些促氧化基因上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平;同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高可通過激活A(yù)TM進(jìn)一步激活p53通路。此時(shí)細(xì)胞內(nèi)存

5、在強(qiáng)大的p53-ROS正反饋環(huán)，持續(xù)的信號(hào)反饋激活后最終引起壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)在我們的研究體系中p53-ROS正反饋環(huán)調(diào)控壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，而CUL4B正是通過抑制這一正反饋環(huán)的信號(hào)激活減緩了壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
　　我們發(fā)現(xiàn)氧化壓力刺激后CUL4B能促進(jìn)p53泛素化，進(jìn)而促進(jìn)了p53的蛋白降解過程。氧化壓力刺激后，CUL4B缺失將引起p53半衰期的延長(zhǎng)而CUL4B過表達(dá)則引起p53半衰期的縮短，并且我們?cè)贜

6、HF細(xì)胞中檢測(cè)到CUL4B蛋白與p53蛋白的直接結(jié)合，進(jìn)一步的泛素化實(shí)驗(yàn)也顯示壓力刺激下CUL4B能促進(jìn)p53的泛素化。
　　綜上所述，我們的結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，這種下調(diào)抑制了p53的泛素化降解從而延長(zhǎng)了p53的半衰期，進(jìn)而造成了p53-ROS正反饋環(huán)的持續(xù)激活，最終抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老;CUL4B過表達(dá)后，經(jīng)壓力刺激時(shí)p53泛素化降解加快半衰期縮短，從而顯著抑制p53-ROS正反饋環(huán)的激

7、活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。我們的研究推進(jìn)了對(duì)p53在壓力誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過程中的作用以及其上游調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　第一部分 CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)
　　Cullin家族是目前已知最大的一類E3泛素連接酶，其中CUL4B是該家族的重要成員。CUL4B在多種表觀修飾和生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。該基因在多種腫瘤組織中過表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性程度，而CUL4B低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)為增殖減緩，細(xì)胞惡

8、性程度降低。此外，CUL4B在表觀調(diào)控方面抑制了一些衰老相關(guān)基因的表達(dá)，例如p16和CXCR2，由此我們推測(cè)CUL4B在細(xì)胞衰老過程中可能發(fā)揮作用。為此，我們首先檢測(cè)了CUL4B在多種類型衰老細(xì)胞中的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞（電離輻射，H2O2或羥基脲誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞）中蛋白表達(dá)水平下調(diào)而在端粒縮短引起的復(fù)制衰老細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平不變。并且我們進(jìn)一步在小鼠耳朵成纖維細(xì)胞(MSF)中檢測(cè)了CUL4B的蛋白表達(dá)情況

9、，結(jié)果表明這種經(jīng)受較強(qiáng)氧化壓力的小鼠細(xì)胞衰老后CUL4B的蛋白表達(dá)水平同樣顯著下調(diào)。值得一提的是壓力誘導(dǎo)早衰細(xì)胞中CUL4B蛋白水平的下調(diào)并沒有伴隨轉(zhuǎn)錄水平的改變，因此CUL4B的蛋白表達(dá)下調(diào)不是由于轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)引起的，這種蛋白水平的顯著下調(diào)可能是通過蛋白降解或microRNA的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 CUL4B抑制壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰
　　伴隨細(xì)胞衰老會(huì)有一系列基因表達(dá)水平的改變，這些改變可能是衰老發(fā)生的一部分原因也可能

10、是衰老發(fā)生后的一種結(jié)果。通過第一部分結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)壓力誘導(dǎo)細(xì)胞早衰后CUL4B蛋白水平顯著下調(diào)，但我們并不清楚這種下調(diào)是細(xì)胞衰老的原因還是結(jié)果。為了解開這一疑惑，我們構(gòu)建了CUL4B低表達(dá)和過表達(dá)的細(xì)胞系，并利用這些細(xì)胞系進(jìn)行了一系列的壓力刺激后早衰情況的檢測(cè)。結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B低表達(dá)細(xì)胞的衰老染色陽(yáng)性比例顯著升高而BrdU摻入比例顯著降低;與此相對(duì)應(yīng)的是CUL4B過表達(dá)細(xì)胞的衰老染色陽(yáng)性比例顯著降低而BrdU摻入比例顯著升高，

11、即CUL4B低表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞早衰而CUL4B過表達(dá)則顯著減緩細(xì)胞早衰。與以上結(jié)果相對(duì)應(yīng)的是CUL4B在復(fù)制衰老中不存在蛋白水平的顯著下調(diào)，其表達(dá)水平的改變也不會(huì)影響復(fù)制衰老。此外，Cul4b敲除小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞相對(duì)于野生型小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞在氧化壓力下更容易衰老。而CUL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的耳朵成纖維細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞對(duì)細(xì)胞早衰有顯著的抵抗作用。并且CUL4B表達(dá)情況的改變不影響壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述，CUL4B表達(dá)水平顯著影

12、響壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老進(jìn)程。
　　第三部分 CUL4B對(duì)p53-ROS正反饋環(huán)的負(fù)調(diào)控
　　抑癌基因p53是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，壓力刺激后p53可被磷酸化激活，這種活性狀態(tài)的p53進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子處調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。其下游靶基因中包含大量的抗氧化及促氧化相關(guān)基因。較為緩和的壓力刺激下，p53可通過下游抗氧化基因發(fā)揮抗氧化作用;而強(qiáng)烈壓力刺激下p53通常通過下游促氧化基因發(fā)揮促氧化作用。p53野生細(xì)胞受MDM

13、2拮抗劑Nutlin-3處理后細(xì)胞ROS水平顯著升高，而p53缺失后這一升高現(xiàn)象被完全抑制。這一現(xiàn)象表明p53可通過調(diào)控這些氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)而調(diào)控ROS的水平?；钚匝?ROS)是細(xì)胞正常代謝的一種產(chǎn)物，細(xì)胞維持一定水平的ROS也是維持細(xì)胞增殖所必須的，但是過高水平的ROS會(huì)引起細(xì)胞強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)并使細(xì)胞走向衰老或凋亡。ROS可通過激活A(yù)TM而進(jìn)一步激活p53通路，因此細(xì)胞內(nèi)存在p53-ROS反饋環(huán)。強(qiáng)烈壓力刺激下，p53-ROS正

14、反饋環(huán)會(huì)使信號(hào)持續(xù)激活從而促進(jìn)細(xì)胞衰老或凋亡。為了探究CUL4B抑制細(xì)胞早衰的調(diào)控機(jī)制，我們用雙氧水和Nutlin-3分別處理CUL4B低表達(dá)及過表達(dá)的細(xì)胞48小時(shí)，之后對(duì)細(xì)胞的ROS水平及p53的激活水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示壓力刺激后CUL4B低表達(dá)細(xì)胞活性氧水平及p53激活情況顯著高于對(duì)照細(xì)胞;而CUL4B過表達(dá)細(xì)胞活性氧水平及p53激活情況均受到一定程度的抑制。我們由此推測(cè)CUL4B低表達(dá)強(qiáng)化了p53-ROS正反饋環(huán)，而CUL4B過

15、表達(dá)抑制了這一反饋環(huán)。我們進(jìn)一步證實(shí)CUL4B對(duì)細(xì)胞早衰的調(diào)控依賴于p53-ROS正反饋環(huán)?；钚匝跚宄齽㎞-乙?；腚装彼?NAC)的拯救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CUL4B缺失促進(jìn)的早衰以及p53的過度激活依賴于細(xì)胞內(nèi)過量產(chǎn)生的ROS。而同時(shí)干擾CUL4B和p53后CUL4B低表達(dá)引起的過度早衰被完全逆轉(zhuǎn)，這一拯救實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明CUL4B缺失對(duì)細(xì)胞早衰的促進(jìn)依賴于p53。綜上所述，CUL4B缺失后持續(xù)激活的p53-ROS正反饋環(huán)促進(jìn)了細(xì)胞早衰，而

16、CUL4B過表達(dá)則通過抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰。
　　第四部分 CUL4B促進(jìn)p53的泛素化及蛋白降解
　　CUL4A與CUL4B存在大量的同源序列，因此在細(xì)胞功能上經(jīng)常發(fā)揮類似作用。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CUL4A可促進(jìn)p53的泛素化降解，所以接下來我們檢測(cè)了CUL4B對(duì)p53泛素化的影響。我們發(fā)現(xiàn)壓力刺激后CUL4B能促進(jìn)p53泛素化并促進(jìn)p53的蛋白降解。氧化壓力刺激后，CUL4B缺失引起p53半衰期的延