腺病毒介導(dǎo)的RPL23基因轉(zhuǎn)染通過對(duì)MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)抑制p53野生型胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng).pdf

1、p53的失活是腫瘤轉(zhuǎn)化過程中最常見的事件之一。人類大部分腫瘤的發(fā)生和發(fā)展同p53的變異和缺失密切相關(guān)。p53在人類腫瘤中突變率很高，平均達(dá)到50％；盡管如此，仍有約50％的腫瘤表達(dá)野生型p53（wt-p53），其中多數(shù)因細(xì)胞內(nèi)降解代謝或下游信號(hào)通路的改變而致p53正常功能缺失。
　　MDM2在調(diào)節(jié)p53濃度及活性中起關(guān)鍵作用。在正常細(xì)胞中，MDM2通過對(duì)p53蛋白持續(xù)而又快速的降解使p53活性保持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃剑@是生物體維持正

2、常生長(zhǎng)的一種平衡調(diào)控手段。MDM2本身是p53的轉(zhuǎn)錄靶基因，因而兩者構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路，調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性。但在一些細(xì)胞中，由于基因擴(kuò)增或其它原因?qū)е翸DM2水平的升高，從而導(dǎo)致對(duì)p53產(chǎn)生構(gòu)成性的、非正常的抑制作用，并且不可逆地促使其降解，使p53對(duì)細(xì)胞正常的調(diào)控平衡被破壞，造成細(xì)胞生長(zhǎng)失控，因而變得具有腫瘤細(xì)胞的特性。
　　將p53從被MDM2的抑制中釋放出來或阻斷MDM2與其它基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用以恢復(fù)p53的正常功能，即可抑

3、制癌的發(fā)生或發(fā)展。已有的研究顯示，核糖體蛋白L23（RPL23）是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)MDM2-p53反饋環(huán)的一個(gè)重要分子。通過與MDM2的直接結(jié)合，RPL23抑制MDM2對(duì)p53的泛素化和降解而間接促使wt-p53功能的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞周期阻滯和/或凋亡。此外，研究顯示外源性表達(dá)的RPL23在胞核和胞漿內(nèi)均可與MDM2結(jié)合，提示RPL23蛋白可以復(fù)合物的形式將MDM2阻滯于胞核或胞漿，進(jìn)而間接抑制MDM2與p53的結(jié)合及對(duì)p53的

4、泛素化和降解?；诖?，我們?cè)O(shè)想以RPL23基因?yàn)榘悬c(diǎn)的腫瘤基因治療是一可行策略。
　　目的：
　　探討腺病毒介導(dǎo)的RPL23基因轉(zhuǎn)染是否可通過對(duì)MDM2-p53相互作用的抑制誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)源性wt-p53蛋白的積聚活化并進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。
　　方法：
　　1、利用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察p53和MDM2在胃癌組織中的表達(dá)情況；2、構(gòu)建rAd5-RPL23重組腺病毒，并利用WesternBlot、免疫沉淀及免疫熒光

5、染色等方法鑒定其對(duì)胃癌細(xì)胞MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)；3、應(yīng)用Ad-RPL23重組腺病毒轉(zhuǎn)染wt-p53型胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和MKN45，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞周期和/或凋亡的影響，并進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證Ad-RPL23重組腺病毒對(duì)p53野生型胃癌的生長(zhǎng)抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、p53和MDM2在胃癌組織中的表達(dá)及意義
　　我們利用免疫組化染色檢測(cè)了p53和MDM2在94例胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)。結(jié)果顯示：p5

6、3（突變型）的檢出率為36％（34/94），此外，在這些可以檢出突變型p53蛋白表達(dá)的胃癌原發(fā)灶中并非所有癌細(xì)胞均是p53陽性表達(dá)，其陽性率差異比較大，從10％-99％，均數(shù)約30％，提示在胃癌原發(fā)灶中有更多的癌細(xì)胞為p53野生型；在62.8％(59/94)的胃癌原發(fā)灶中可以檢測(cè)到MDM2表達(dá)，定位于胞漿和胞核，并且呈異質(zhì)性表達(dá)；在我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDM2表達(dá)陽性率顯著高于原發(fā)灶，提示MDM2的水平增高可能與胃癌細(xì)胞的

7、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　2、Ad-RPL23重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)
　　本研究首先利用武漢晶賽公司AdenovirusExpressionSystem重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)成功構(gòu)建了rAd5-RPL23（Ad-RPL23），隨后利用WesternBlot、免疫共沉淀和免疫熒光等方法證實(shí)在胃癌細(xì)胞系MKN45中外源性RPL23蛋白可與內(nèi)源性MDM2蛋白相互結(jié)合并抑制其E3泛素酶活性，進(jìn)而誘導(dǎo)wt-p53蛋白

8、的積聚活化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)Ad-RPL23誘導(dǎo)的p53活化源于其對(duì)MDM2降解p53過程的抑制。
　　3、Ad-RPL23轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期和/或凋亡的影響
　　Ad-RPL23轉(zhuǎn)染后，p53野生型人胃癌細(xì)胞系MKN45和AGS出現(xiàn)G1-S期阻滯，WesternBlot結(jié)果顯示，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染的MKN45和AGS細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平與MDM2蛋白表達(dá)水平具有一致性，顯示外源性RPL23表達(dá)可抑制MDM2-p

9、53相互作用并引起p53積聚活化，進(jìn)而誘導(dǎo)p21的表達(dá)。此外，在MKN45細(xì)胞中，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染可以誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡，WesternBlot結(jié)果顯示，作為p53轉(zhuǎn)錄的靶基因，Bax和PUMA，兩個(gè)已知的凋亡相關(guān)分子，表達(dá)均明顯上調(diào)。在p53突變型胃癌細(xì)胞系MGC803中，Ad-RPL23轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期及凋亡未有影響，顯示外源性的RPL23是通過p53途徑發(fā)揮其抑癌效應(yīng)的。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果?？傊?，本實(shí)驗(yàn)提供的數(shù)