野生型p53基因抑制Hela細(xì)胞生長的研究.pdf

1、目的：研究外源性野生型p53（wt p53）基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞中的致癌基因環(huán)氧合酶-2（COX-2）的影響，以及對HeLa細(xì)胞的生長的抑制作用。 方法： 1、體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞 2、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有人野生型p53基因的pCMV-Script重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，篩選陽性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)，從而獲得實驗組為p53轉(zhuǎn)染組（p53-hela組） 3、未轉(zhuǎn)染的宮頸癌Hela細(xì)胞為

2、空白對照組（hela組） 4、wt p53的表達(dá)使用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)鑒定（RT-PCR），并檢測快速轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后p53mRNA和COX-2mRNA后表達(dá)的變化。細(xì)胞計數(shù)試劑盒CCK-8染色法繪制細(xì)胞生長曲線。觀察wt P53對Hela細(xì)胞的增殖抑制 結(jié)果： 1、pCMV-Script p53質(zhì)粒的鑒定 pCMV-Script p53質(zhì)粒經(jīng)0．8％瓊脂糖電泳示1條6kb mRNA條帶，即pCMV-

3、Script p53重組質(zhì)粒mRNA。 2、轉(zhuǎn)染前Hela細(xì)胞中p53表達(dá) 轉(zhuǎn)染前Hela細(xì)胞中有少量p53mRNA表達(dá)，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中的p53逐漸減少。 3、Hela細(xì)胞中p53基因的轉(zhuǎn)染及篩選情況 Hela細(xì)胞受到外源性p53基因轉(zhuǎn)染后，未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞在G418（400ug/ml）環(huán)境中生長受到抑制，16天后大部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡脫落，剩余細(xì)胞形成細(xì)胞陽性克隆。1周后G4

4、18使用維持劑量（200ug/ml），擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆細(xì)胞，實驗組的陽性克隆數(shù)為（20±3），而空白對照組陽性克隆數(shù)只有1-2個，后者明顯少于前者（t=36．714，p=0．001<0．01）。對照組Hela組細(xì)胞在G418環(huán)境中逐漸死亡，最終全部脫落。 4、快速轉(zhuǎn)染p53-hela組細(xì)胞檢測p53mRNA和COX-2mRNA轉(zhuǎn)染后表達(dá)，除轉(zhuǎn)染24h后p53mRNA的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)意義外（p=0．210），其余的均有統(tǒng)計學(xué)差異。

5、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p53-hela組細(xì)胞檢測p53mRNA和COX-2mRNA轉(zhuǎn)染后表達(dá)各時間段均有統(tǒng)計學(xué)意義。 5、2組細(xì)胞生長曲線顯示p53-hela細(xì)胞生長明顯慢于未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，pCMV-Script p53轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后測定細(xì)胞生長抑制率。結(jié)果顯示實驗組的細(xì)胞生長抑制率分別為7．95±3．98％，5．77±2．34％，3．25±0．5％。 結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，p53-

6、hela中的p53mRNA越來越多，而COX-2mRNA越來越少，對照組中的情況相反。這點可證實wtp53對COX-2的抑制作用；另一方面，從細(xì)胞生長曲線可以看出，轉(zhuǎn)染細(xì)胞p53-hela生長緩慢，而對照組Hela細(xì)胞生長速度明顯，保持了其惡性生長的特點。 結(jié)論： 1、野生型p53基因轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞中的p53mRNA表達(dá)增加，COX-2mRNA表達(dá)減少。通過對細(xì)胞生長曲線的分析，轉(zhuǎn)染后與轉(zhuǎn)染前相比，生長明顯減慢（p<

7、0．01），wtp53對Hela細(xì)胞有抑制作用。 2、隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，p53-hela中的p53mRNA越來越多，而COX-2mRNA越來越少，對照組中的情況相反。這點可證實wt p53對COX-2的抑制作用 3、從細(xì)胞生長曲線可以看出，轉(zhuǎn)染細(xì)胞p53-hela生長緩慢，而對照組Hela細(xì)胞生長速度明顯，保持了其惡性生長的特點。 4、外源性wt p53基因表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞中COX-2mRNA的表達(dá)