rAAV-LyoVec載體介導(dǎo)的血管抑素和野生型p53聯(lián)合基因治療腦膠質(zhì)瘤研究.pdf

1、目的： 1992年，美國NIH批準(zhǔn)了第一個神經(jīng)分子外科臨床方案，即運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retrovirus，RV)介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶基因/環(huán)丙氧苷(HSR-tk/GCV)系統(tǒng)治療腦膠質(zhì)瘤，在全球范圍內(nèi)引起了醫(yī)學(xué)界人士對惡性腫瘤基因治療的廣泛關(guān)注。目前世界上共有232項基因治療臨床試驗方案獲準(zhǔn)進(jìn)行，其中105項是針對惡性腫瘤的基因治療，14項是針對腦膠質(zhì)瘤，但至今取得理想治療效果的報道甚少。隨著人腦膠質(zhì)瘤基因治療的基礎(chǔ)及臨床

2、研究不斷發(fā)展，越來越多的聯(lián)合治療方案的提出，將為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供全新的模式。本研究旨在構(gòu)建一種安全、無輔助病毒污染的、無病毒基因的新型rAAV病毒載體，驗證其轉(zhuǎn)染效率。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗證該載體攜帶血管抑素基因和野生型p53基因在體內(nèi)條件下聯(lián)合治療惡性膠質(zhì)瘤的效果，探索一套安全、有效治療膠質(zhì)瘤的基因治療方法。 研究分三步進(jìn)行： 1．重組腺病毒相關(guān)病毒(reconstruct adenovirus-associated

3、 virus，rAAV)-陽離子脂質(zhì)體(LyoVec)載體的構(gòu)建及評價本研究構(gòu)建了rAAV-GFP無病毒基因的且無輔助病毒污染的病毒載體、rAAV-GFP-LyoVec新型載體，體外實驗測定此兩種載體及LyoVec-GFP對定量C6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，篩選并確定高轉(zhuǎn)染率載體，按產(chǎn)業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善其構(gòu)建方式，為該載體攜帶血管抑素和野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤做準(zhǔn)備。 2．裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定裸鼠腫瘤模型是人們研究人類腫

4、瘤生物特性以及腫瘤治療常用的實驗?zāi)Ｐ?，適用于異種動物組織的移植和人類腫瘤異種移植。這種模型可以保持原發(fā)腫瘤本身所具有的形態(tài)特征和遺傳性。本實驗為研究人腦膠質(zhì)瘤的基因治療效果建立了裸鼠C6膠質(zhì)瘤的模型，體內(nèi)、體外實驗免疫組化檢測GFAP蛋白的表達(dá)，鑒定其遺傳性，研究其病理組織學(xué)特征。 3．rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤用rAAV-LyoVec載體介導(dǎo)血管抑素基因及野生型p53基因

5、聯(lián)合治療C6膠質(zhì)瘤．觀察所構(gòu)建的裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型中各組不同時間段腫瘤體積變化，免疫組織化學(xué)分析血管抑素基因、野生型p53基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)，電鏡觀察C6細(xì)胞凋亡、病毒轉(zhuǎn)染、組織壞死等情況，RT-PCR確認(rèn)血管抑素基因在分子水平表達(dá)。 實驗材料及方法： 1．rAAV-LyoVec載體的構(gòu)建及評價 1．1無病毒基因的病毒載體構(gòu)建： 通用型AAV載體pSNAV、含GFP基因表達(dá)盒的AAV載體質(zhì)粒的構(gòu)建采用文

6、獻(xiàn)方法進(jìn)行，得到的重組質(zhì)粒為pSNAV-GFP，轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，將其進(jìn)行G418抗性篩選，得細(xì)胞株命名為293-SG1。293-SG1在37℃5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，搜集細(xì)胞，低速離心，去上清，將細(xì)胞團(tuán)快速凍融3次，裂解液在55-60℃加熱30min以滅活殘存腺病毒，低速離心去除細(xì)胞碎片得rAAV-GFP粗提物，純化后，按照氯仿處理-PEG/NaCI沉淀-氯仿抽提濃縮法進(jìn)一步純化，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，加入10％體積的氯仿，劇

7、烈振搖，加入固體NaCI至終濃度為1mol/L，離心，收集上清，加入PEGS000至終濃度為10％，離心，棄上清，用PBS重懸沉淀，加入DNaseI至終濃度為1ug/ml，氯仿抽提，收集水相即為純化的rAAV-GFP。 1．2 rAAV-GFP-LyoVec新型載體的構(gòu)建準(zhǔn)備rAAV-GFP 80ul，加入RPMI 1640液320ul，LyoVec2ml，取TMAG：DLPC：DOPE摩爾比率是1：2：2(總量是1umol)，

8、溶解在0.5ml氯仿中，溶劑蒸發(fā)，脂膜浸濕在0.2ml含有1.5×10<'8>rAAV-GFP粒子的PBS溶液中，用渦輪攪拌器混合攪拌2min，懸浮體積用PBS溶液調(diào)到0.5ml，未捕獲rAAV-GFP的LyoVec載體通過浮選轉(zhuǎn)移到Ficoll梯度上．此0.5ml溶液含有rAAV-GFP聯(lián)接LyoVec，它包括1.5×10<'8>rAAV-GFP粒子/umol脂質(zhì)。 脂質(zhì)體的數(shù)量已控制在15nmol/ml脂質(zhì)(1.5×10<'

9、8>粒子/ml)，至此含1.5×10<'8>rAAV-GFP-LyoVec粒子新型載體0.5ml構(gòu)建完畢．放入37℃ 5％CO培養(yǎng)箱保存。 1．3 rAAV-GFP，LyoVec-GFP，rAAV-GFP-LyoVec新型載體三組體外轉(zhuǎn)染定量C6細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡記數(shù)，轉(zhuǎn)染率比較。 2．裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定 2．1動物：6只15周雌性裸鼠，體重15-20g，購于中國醫(yī)科大學(xué)動物部。 2．2細(xì)胞

10、培養(yǎng)：大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10％血清的DMEM培養(yǎng)基(青霉素105u/L，鏈霉素100mg/L)中，置于37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期。 2．3瘤細(xì)胞懸液接種法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，離心棄上清，用無血清培養(yǎng)液DMEM離心洗滌2次，計數(shù)細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸浮于PBS(0.01mol/L pH7.4)中，細(xì)胞濃度為5×10<'6>/ml。抽取細(xì)胞懸液200ul(1×10<'6>

11、個)，接種6只裸鼠的腋下。 2．4腫瘤的觀察和測量裸鼠接種完畢后，置恒溫(25±2℃)、恒濕(45％～50％)、無菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。三維卡規(guī)測量：V(cm<'3>)=,πD<'3>/6(D為腫瘤最大及最短徑的平均值)，繪制裸鼠瘤體體積-時間曲線。 2．5病理組織學(xué)檢查處死裸鼠，觀察移植瘤的形態(tài)。取腫瘤組織固定于10％福爾馬林溶液中，石蠟包埋，組織切片，常規(guī)HE染色，組織病理檢查。

12、 2．6免疫組化檢測GFAP蛋白的表達(dá)取體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞爬片以及裸鼠移植瘤組織，免疫組化(ABC法)檢測GFAP蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)胞漿棕黃色著染，胞核蘇木精復(fù)染。 3．rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤 3．1 取36只C6膠質(zhì)瘤模型裸鼠，隨機(jī)分為6組，每組各6只： 1組PBS空白對照2組LyoVec對照3組rAAV-p53-LyoVec4組rAAV-

13、angiastain-LyoVec5組rAAV-p53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec6組卡鉑組(澳大立亞科鼎公司提供)C6細(xì)胞懸液接種法接種4d后，各組鼠均已成瘤，瘤體內(nèi)注射治療，1組各鼠分別加入PBS 50ul，2、3、4、5組按50ul/只(1.5×10<'8>粒子/ml)注射各組基因，6組按0.3mg/20mg體重(10mg/ml)注射，每24h注射一次，分別在4d，12d，20d，28d，36d測量

14、成瘤體積。三維卡規(guī)測量：V(cm<'3>)=,πD<'3>/6，D為腫瘤最大及最短徑的平均值。 3．2 免疫組織化學(xué)檢測及HE染色：取各組C6移植瘤，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋封固，切片，免疫組化SABC法檢測各組膠質(zhì)瘤內(nèi)p53，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，CD34蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。 3．3 RT-PCR進(jìn)一步測定angiastain各組C6轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分子水平表達(dá)引物由中科院上海生物工程公司合成。 提取4、5兩組C

15、6轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿中的RNA及poly(A)+RNA，然后進(jìn)行cDNA合成，將cDNA直接用于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，樣品4℃保存。取5ul反應(yīng)液置瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。 實驗結(jié)果： 1．rAAV-LyoVec載體的構(gòu)建及評價1．1成功構(gòu)建rAAv-GFP LyoVec新型載體，1．2 rAAV-GFP，LyoVec-GFP，rAAv-GFP-LyoVec三組載體體外轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，MOI(mul

16、tiplicity of infection)為10<'5>v．g/cell。即病毒基因組數(shù)(v．g)與轉(zhuǎn)染細(xì)胞之比為10<'5>。倒置熒光顯微鏡記數(shù)，轉(zhuǎn)染率比較．rAAV -GFP-LyoVec組高于rAAV-GFP組和LyoVec-GFP組。 2．裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定建立了裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型，裸鼠的腋下移植瘤生長潛伏期為4天，繪制裸鼠腫瘤體積-時間生長曲線。 3．rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑

17、素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤 3．1 建立了腫瘤體積-時間生長曲線。 3．2 免疫組織化學(xué)檢測及HE染色顯示，各組細(xì)胞p53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表達(dá)。 3．3 在4、5組經(jīng)RT-PCR獲得一個基因片斷，電泳證實為angiastain基因片斷，其它組未見。 結(jié)論： 1．新構(gòu)建rAAV-LyoVec載體基因的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于rAAV或LyoVec獨(dú)立轉(zhuǎn)染。 2．裸鼠