BMSCs作為腦膠質(zhì)瘤基因治療的載體的可行性研究.pdf

1、目的：本實驗通過對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定來觀察BMSCs的基本生物學特性；用Transwell細胞遷移實驗來觀察BMSCs是否具有對C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞的趨向性、追蹤能力。通過以上實驗來研究BMSCs作為人類腦膠質(zhì)瘤基因治療的外源性基因的靶細胞的可行性，為人類腦膠質(zhì)瘤的基因治療篩選理想的靶細胞。 方法：1．無菌條件下取出SD大鼠長骨骨髓，用貼壁法來分離、純化培養(yǎng)BMSCs。 2．利用

2、流式細胞儀對BMSCs的表面抗原進行鑒定，并計算所得細胞純度。 3．用Transwell培養(yǎng)板來完成BMSCs對C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞的趨向性實驗：在Transwell培養(yǎng)板的Transwell中放置一定量的用BrdU標記的BMSCs，Transwell培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中分別放置：IMDM培養(yǎng)基、C6細胞條件培養(yǎng)液、MRC-5細胞（人成纖維細胞）、C6鼠膠質(zhì)瘤細胞。將以上Transwell培養(yǎng)板在CO<,2>恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后，

3、在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍攝照片，然后取胰酶加入培養(yǎng)孔中消化細胞5分鐘，拿掉Transwell，取適量細胞懸液滴加在載波片上，然后將4％多聚甲醛滴加在載波片上的細胞上將其固定30分鐘。 4．對已固定的細胞用S-ABC法對BrdU進行免疫組化染色。 5．在顯微圖像分析儀下觀察BrdU，免疫組化染色陽性的細胞并計數(shù)。 6．對所得數(shù)據(jù)用Sigma Stat 2.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理（齊性檢驗，單因素方差

4、分析）。 結(jié)果：1．我們觀察到用貼壁法可制得較高純度的BMSCs，經(jīng)流式細胞儀鑒定BMSCs 純度達99％。BMSCs在塑料培養(yǎng)瓶中易貼壁生長，形狀為圓形、梭形、多邊形，有細胞核。BMSCs在體外培養(yǎng)時要經(jīng)歷生長滯緩期、對數(shù)增長期、平臺期，具有較強的自我增殖能力，生物學性狀穩(wěn)定。2．經(jīng)流式細胞儀鑒定BMSCs表達間充質(zhì)細胞相關(guān)的抗原標記：CD29、CD44、CD105，但不表達CD19、CD34、CD45、CD106，表

5、明BMSCs是骨髓中區(qū)別于造血干細胞的細胞。 3．經(jīng)BrdU免疫組化染色后BMSCs呈現(xiàn)深褐色，可明顯區(qū)別與其它細胞。 4．遷移到C6及其條件培養(yǎng)液組的BMSCs明顯多于IMDM和MRC-5組，并有統(tǒng)計學意義上的差別，且C6及其條件培養(yǎng)液組之間也有統(tǒng)計學意義上的差別，IMDM和MRC-5組兩組之間無統(tǒng)計學意義上的差別。 結(jié)論：應(yīng)用貼壁法制備BMSCs時所需設(shè)備簡單、操作容易、不易發(fā)生污染、對細胞干擾小，經(jīng)過多次換

6、液，能獲得較高純度的BMSCs。 BMSCs具有較強的自我增殖能力，生物學性狀穩(wěn)定，易于保存復蘇，能表達非造血干細胞的表面標志。 BMSCs與NSCs一樣具有對膠質(zhì)瘤細胞的趨向性、追蹤能力。 BMSCs具備作為腦膠質(zhì)瘤基因治療外源性治療基因的載體的基本條件，是一種很有希望的基因治療的靶細胞，進一步的研究后可把相關(guān)敏感治療基因以BMSCs為載體導入顱內(nèi)或直接導入膠質(zhì)瘤內(nèi)，讓治療基因表達殺死腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞生長