PTEN基因重組腺病毒治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤作為人類最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,有很高的發(fā)病率和死亡率。約占成人顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的30％-50％,近年來發(fā)病率還有增加的趨勢。惡性腫瘤的常規(guī)治療手段,如手術(shù)、放療、化療、生物治療等對膠質(zhì)瘤的治療,效果甚微,膠質(zhì)瘤患者的平均生存期仍較短。迄今的治療方法都不能從根本上治療這一致命的腫瘤。因而新療法的探索成為熱點(diǎn)課題?；蛑委熥鳛橹委熂膊〉囊环N新手段,正愈來愈受到人們的重視和關(guān)注。常用的基因治療的方法包括基因置換和增補(bǔ)缺陷基因。將抑癌基因

2、轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞是直接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞的最有效的基因治療的措施之一。
　　 PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10)抑癌基因,即第10號(hào)染色體缺失的與張力蛋白同源的基因,是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有雙特異性的抑癌基因,在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的表達(dá)譜中缺失。PTEN基因位于10號(hào)染色體q23.3,有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。第5個(gè)外顯子編碼第122和123位氨基酸,該

3、編碼序列與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶催化中心具有同源序列,表明該區(qū)域具有雙特異性磷酸酶功能。PTEN蛋白所具有的雙特異性磷酸酯酶的活性在抑制腫瘤中具有極其重要的作用,除了能使磷酸絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸去磷酸化,發(fā)揮蛋白磷酸酯酶的作用外,還能通過抑制1-磷酸酰肌醇-3-激酶(PI3K)的產(chǎn)物磷酸酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的磷酸化,發(fā)揮脂性磷酸脂酶的功能,在PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PTEN直接使P

4、IP3的D3位去磷酸化,這是PTEN抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)凋亡的重要機(jī)制。PTEN蛋白的表達(dá)能抑制PI3K激酶信號(hào)通路介導(dǎo)的下游事件,如:PKB/Akt細(xì)胞存活增殖信號(hào)的激活,促進(jìn)G1細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換P70S6-激酶的激活。PTEN基因已經(jīng)成為有市場前景的抑癌基因。
　　 為進(jìn)一步探討PTEN基因及蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的作用,我們通過臨床研究和基礎(chǔ)研究兩方面深入分析了PTEN在腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制。通過研究我們檢測了PTEN基因水平以及蛋白

5、水平在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。通過基礎(chǔ)研究我們將外源性野生型PTEN轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,觀察野生型PTEN在體外及體內(nèi)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的治療作用,并檢測其可能的作用機(jī)制,為腦膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論依據(jù)。系統(tǒng)的研究PTEN-PI3K-Akt-NF-κB以及下游靶基因的信號(hào)傳導(dǎo)通路,在國內(nèi)外尚無報(bào)道。
　　 第一部分 PTEN在正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究
　　 目的:探討PTEN(phosph

6、atase and tensin homology deleted onchromosome ten)在人腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)以及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP及Western blot檢測人正常腦組織及人腦膠質(zhì)瘤組織中PTEN蛋白水平的表達(dá),半定量RT-PCR法檢測人正常腦組織和人腦膠質(zhì)瘤中PTEN mRNA水平的表達(dá),以及TUNEL法檢測人正常腦組織和人腦膠質(zhì)瘤中細(xì)胞凋亡的情況。
　　

7、結(jié)果:
　　 1 PTEN在正常人腦組織標(biāo)本中過度表達(dá),在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本之中有表達(dá),且隨著級(jí)別的增加表達(dá)的陽性率降低(Fig1),它們從正常到高級(jí)別的陽性率分別為100％、85.7％、63.6％、50％(table.1),低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ-Ⅱ)和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ、Ⅳ)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 PTEN在蛋白水平均為正常腦組織表達(dá)高于人腦膠質(zhì)瘤,隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高,PTEN蛋白表達(dá)水平明顯降低(Fi

8、g2),其相對表達(dá)量分別為0.667±0.203、0.475±0.169、0.237±0.087、0.153±0.046(table2),膠質(zhì)瘤各級(jí)別之間表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 3 PTEN在mRNA水平均為正常腦組織表達(dá)高于人腦膠質(zhì)瘤,隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高,PTENmRNA表達(dá)水平明顯降低(Fig2),其相對表達(dá)量分別為3.767±0.865、2.530±0.619、1.853±0.436、0.688±0.14

9、0(table2),膠質(zhì)瘤各級(jí)別之間表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4 人正常腦組織中細(xì)胞凋亡率明顯低于人腦膠質(zhì)瘤,兩組之間表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)(Fig4),且隨著級(jí)別的增加表達(dá)的細(xì)胞凋亡率降低,它們從正常到高級(jí)別的凋亡率分別為3.2±0.5％、46.4±6.7％、37.2±5.2％、21.2±5.1％(table.4),細(xì)胞凋亡率與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高以及PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)(P＜0.05),

10、隨著PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平表達(dá)升高,細(xì)胞凋亡率隨之下降。
　　 結(jié)論:PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平在人腦膠質(zhì)瘤中隨級(jí)別的升高表達(dá)下降,PTEN與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),可能成為其診療的一個(gè)新的指示靶點(diǎn)。
　　 第二部分 PTEN基因重組腺病毒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響
　　 目的:探討抑癌基因PTEN對人膠質(zhì)瘤U251、U87、A172細(xì)胞系增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響,并對其可能的作用機(jī)制

11、進(jìn)行探討。
　　 方法:將攜帶PTEN及綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-PTEN-GFP)或空載體腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251、U87、A172細(xì)胞系。MTT檢測細(xì)胞生長曲線;TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀檢測Ad-PTEN-GFP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞凋亡率;半定量PCR(RT-PCR)檢測PTEN、CIAP1、CIAP2、XIAP、Survivin mRNA水平變化;Western Blot檢測PTE

12、N、AKT、p-AKT,IκB,P65、CIAP1,CIAP2、XIAP,Survivin、CyclinD1,P27、Bcl-2、Bax蛋白水平變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 攜帶PTEN腺病毒轉(zhuǎn)染的檢測結(jié)果
　　 Ad-PTEN感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,細(xì)胞在第三天達(dá)到最高轉(zhuǎn)染率,當(dāng)感染復(fù)數(shù)(M.O.I)為100時(shí),熒光顯微鏡鏡下顯示細(xì)胞的熒光表達(dá)率均為80％以上(Figl、2、3),符合基因治療對載體的要求。

13、　　 2 MTT檢測細(xì)胞生長曲線
　　 在MOI=100時(shí),Ad-PTEN-GFP轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組各時(shí)間段細(xì)胞吸光度相比,增殖活性程度均降低(P＜0.01 Fig7),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PTEN增高后明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增殖活性。
　　 3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡
　　 在MOI=100時(shí),腺病毒轉(zhuǎn)染U251、U87、A172細(xì)胞系后,分別取1d、3d、5d后轉(zhuǎn)染Ad-PTEN-GFP組細(xì)胞凋亡

14、比例均明顯高于未轉(zhuǎn)染組,且于第5天,細(xì)胞凋亡比率最高(Fig6、9 P＜0.01)。
　　 4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期變化
　　 Ad-PTEN-GFP轉(zhuǎn)染U251、U87、A172細(xì)胞后與Ad-GFP組相比細(xì)胞凋亡率逐漸增加,空白對照和無義序列組相比凋亡率明顯增加,提示PTEN基因表達(dá)上調(diào)明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的凋亡(Fig10)。細(xì)胞周期分析顯示,當(dāng)Ad-PTEN-GFP轉(zhuǎn)染U251、U87、A172細(xì)胞后

15、5天,G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例降低,細(xì)胞周期阻滯于G1期(Fig8);
　　 5 RT-PCR檢測PTEN以及IAP家族mRNA水平
　　 以M.O.I=100轉(zhuǎn)染U251、U87、A172細(xì)胞系1、3、5天,Ad-PTEN-GFP組與Ad-GFP組的CIAPl、CIAP2、XIAP、Survivin mRNA表達(dá)水平相比表達(dá)明顯降低,且于第3天IAP家族mRNA表達(dá)水平降至最低水平。IAP家族mRNA表達(dá)水平與

16、PTEN mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)改變(Fig4、5;table3、4 P＜0.01)。
　　 6 Western blot檢測PTEN及相關(guān)靶基因的蛋白水平
　　 以M.O.I=100轉(zhuǎn)染U251、U87、A172細(xì)胞系1、3、5天,Ad-PTEN-GFP組與Ad-GFP組的AKT、p-Akt、IκB、P65、Iaps、CyclinD1、P27、Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平相比明顯變化,且其蛋白表達(dá)水平與PTEN蛋白表達(dá)

17、水平密切相關(guān)(Fig5,table4)。
　　 結(jié)論:高表達(dá)PTEN能夠明顯抑制人膠質(zhì)瘤U251、U87、A172細(xì)胞系增殖并誘導(dǎo)凋亡,其可能與PTEN-PI3K/AKT-NF-κB信號(hào)通路被激活有關(guān),并通過此通路調(diào)控多種凋亡相關(guān)因子家族,如IAPs及Bcl-2家族,并通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。
　　 第三部分 PTEN基因重組腺病毒抑制裸鼠膠質(zhì)瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討Ad-PTEN對人

18、膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠的治療作用,并對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法:建立裸鼠膠質(zhì)瘤模型;將攜帶Ad-PTEN-GFP或空Ad-GFP注射治療腫瘤,觀察腫瘤生長情況及裸鼠生存期,TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;免疫組化檢查PTEN及P65蛋白水平變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 各組腫瘤生長情況及裸鼠存活時(shí)間
　　 U251細(xì)胞以7×105接種裸鼠后20天左右均可見腫瘤結(jié)節(jié)形成,瘤體內(nèi)注射5次,Ad-PTEN組腫

19、瘤體積生長明顯變慢,較對照組體積小,治療6周后腫瘤體積抑制率82.50％,與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05 Fig5)。U251和Ad-GFP治療組裸鼠腫瘤生長迅速,生存狀態(tài)較差,均在移植后28～80天內(nèi)相繼死亡,兩組裸鼠的平均生存時(shí)間分別54±7天和58±8天,Ad-PTEN治療組裸鼠的生存狀態(tài)明顯好于另外兩組,腫瘤生長緩慢直至移植后120天觀察結(jié)束仍有2只裸鼠存活,平均生存時(shí)間103±10天,生成時(shí)間顯著延長(Fig6)。

20、r>　　 2 各組中目的蛋白及凋亡的表達(dá)
　　 免疫組化顯示PTEN及P65蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核,偶有胞漿表達(dá),著色后成棕黃色、棕褐色顆粒。其Ad-PTEN治療組中PTEN表達(dá)明顯增高,P65表達(dá)明顯降低,細(xì)胞凋亡增加(Figl-3),其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:各組細(xì)胞接種裸鼠后均可見移植瘤的生長,Ad-PTEN治療后能明顯抑制腫瘤在裸鼠內(nèi)的生長,延長裸鼠的生存期,免疫組化結(jié)果提示PTEN可能通過PTEN-