重組分泌型sTRAIL腺病毒的構(gòu)建及其誘導腦膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)基因的重組腺病毒載體,并導入U251腦膠質(zhì)瘤細胞,檢測重組腺病毒sTRAIL誘導的U251膠質(zhì)瘤細胞凋亡及其與細胞周期的關(guān)系。
　　 方法：采用PCR技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中擴增出編碼114-281位氨基酸的TRAIL基因片段。將擴增的TRAIL插入含有分泌性信號肽IL-2的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-IL-2中,命名為pAdTraek-CMV-IL-2

2、-TRAIL。pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL經(jīng)PmeI線性化后,電轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)化了pAdEasy-1的BJ5183細胞。篩選重組腺病毒質(zhì)粒pAd-sTRAIL。經(jīng)HEK293細胞包裝后得到復制缺陷型重組腺病毒Ad-sTRAIL,氯化銫密度梯度離心純化Ad-sTRAIL病毒,并測定病毒滴度。采用RT-PCR法和westernblotting分別檢測目的基岡的表達。細胞培養(yǎng)并用重組腺病毒sTRAIL感染U251膠質(zhì)瘤細胞,光鏡及

3、熒光顯微鏡下觀察U251細胞的形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染成功率,免疫熒光技術(shù)檢測sTRAIL感染U251膠質(zhì)瘤細胞后在細胞內(nèi)的表達,MTT法檢測sTRAIL對U251膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用特點,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及細胞周期,并判斷二者的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：純化后的Ad-sTRAIL病毒滴度為3.12×1015pfu/L。經(jīng)RT-PCR擴增出104bp的基因片段。Weternblot檢測劍目的基因在U251細胞的表達。感染了Ad-sTRA

4、IL的U251細胞在TRAIL的表達和產(chǎn)生過程中增殖能力受到抑制并出現(xiàn)明顯的凋亡,流式細胞術(shù)檢測示G0/G1期、S期細胞比例與對照組相比明顯降低,出現(xiàn)較高的亞二倍體峰。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組分泌型sTRAIL腺病毒載體Ad-sTRAlL,可高效感染U251細胞并表達sTRAIL;Ad-sTRAIL可誘導U251膠質(zhì)瘤細胞凋亡:在一定范圍內(nèi),隨病毒濃度增加或作用時間延長,瘤細胞存活率降低;sTRAIL作用于U251膠質(zhì)瘤細胞