Bim介導FOXO3a對U251膠質瘤細胞凋亡作用的體外實驗研究.pdf

1、目的: 觀察沉默Bim 表達對重新激活FOXO3a 的U251 腦膠質瘤細胞凋亡的影響及凋亡相關蛋白Bim、caspase3 的變化，探究FOXO3a 對人腦膠質瘤U251 細胞凋亡影響的作用機制，為膠質瘤基因治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1. pcDNA3.1-FOXO3a 真核表達載體經(jīng)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ酶切后鑒定。
　　 2. U251 膠質瘤細胞培養(yǎng)、傳代。
　　 3. U251/

2、FOXO3a 細胞被隨機分為四組：對照組，脂質體組，siRNA 陰性對照組及實驗組；實驗組采用陽離子脂質體法將Bim siRNA轉染入經(jīng)4-OH Tamoxifen 誘導的U251/FOXO3a 細胞，分別于轉染后24 h、48 h、72 h 收集細胞，Western blot 檢測FOXO3a、Bim、caspase3 的表達，Hoechst33258染色試劑盒及流式細胞儀（Fluorescein Activated Cell Sor

3、ter，F(xiàn)ACS）檢測細胞凋亡情況。
　　 結果:
　　 1. pcDNA3.1-FOXO3a 真核表達載體轉染U251 細胞，經(jīng)G418 篩選獲得穩(wěn)定表達非磷酸化型FOXO3a 的U251/FOXO3a 細胞株。
　　 2. Western blot 檢測結果顯示：Bim siRNA 轉染4-OH Tamoxifen 誘導的U251/FOXO3a 細胞后24 h、48 h、72 h，與對照組相比，實驗組FOXO

4、3a 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Bim、caspase3 表達水平較低（P＜0.05），至48 h 蛋白表達水平達最低。
　　 3.Hoechst33258 染色及FACS 檢測細胞凋亡率顯示：Bim siRNA 轉染FOXO3a/U251細胞后24 h、48 h、72 h，細胞凋亡率均低于對照組（P＜0.05），實驗組各時間點差別無統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1. 獲得穩(wěn)定表達非磷酸化型F