多重修飾的明膠—硅氧烷納米粒作為基因載體腦膠質瘤細胞靶向研究.pdf

1、腦膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，是最常見的顱內腫瘤，其化療效果欠佳的主要原因就是中樞神經系統(tǒng)受到血腦屏障的保護。血腦屏障(bloodbrainbarrier，BBB)是由腦內毛細血管的內皮和內皮細胞之間的緊密連接、基膜以及神經膠質細胞突起構成，這種結構的存在，阻止了極性分子在細胞旁的自由擴散。而且在大腦內皮細胞表面沒有窗孔、吞飲小泡極少，98％的藥物、外源基因不能透過血腦屏障達到良好的藥物濃度。近些年基因治療的廣泛開展，為腦膠質瘤的治療

2、提供了新的契機，因此高效性基因載體的研究變成了重中之重。作為非病毒藥物載體中重要的一員，納米粒子發(fā)揮著無可替代的作用，而其中的明膠-硅氧烷雜化材料，由于具有低毒性、可降解性、表面易修飾性以及易重復合成等優(yōu)點在提高藥物靶向性方面具有非常廣闊的應用前景。
　　 本實驗旨在構建一種經陽離子多肽和適配體共修飾的不但能夠很好的被細胞攝取并能靶向腦腫瘤細胞的納米粒子基因載體系統(tǒng)，并考察其攜帶質粒DNA在細胞水平的轉染效率。
　　 本

3、文工作主要分為以下三個方面:
　　 1.通過兩步溶膠-凝膠法制備出明膠-硅氧烷納米粒子(gelatin-siloxanenanoparticlesGSNPs)后，通過靜電吸附作用使得目的基因熒光素酶質粒pGL3連接，然后通過靶向識別人腦膠質瘤U251細胞的適配體TTA1(5'-CCTGCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC-3')、提高納米粒子穿透血腦屏障和細胞膜的陽離子多肽TAT（YGRKKRRQRRR）

4、、延長藥物體內循環(huán)時間的聚乙二醇(Poly(ethyleneglycol)，PEG）對其進行表面修飾。并經透射電鏡、熒光光譜儀、Zeta電位儀、粒徑儀等對其進行理化性能分析。實驗結果證實了適配體TTA1和陽離子多肽TAT可以成功連接到納米粒子表面，其納米粒子表面形態(tài)，修飾前后無明顯差異;但納米粒子直徑，隨著多重修飾的增加，粒徑有不同程度的增大。
　　 2.通過體外毒性試驗對經過適配體TTA1、陽離子多肽TAT、聚乙二醇(PEG)

5、修飾后的明膠-硅氧烷粒子與DNA的復合物進行細胞生物相容性評價，實驗證實，經多重修飾的明膠-硅氧烷納米粒子細胞毒性較未經修飾的該納米粒細胞毒性增加，當各種納米粒子與DNA的復合物的濃度為100μg/mL時，與細胞共培養(yǎng)24h后，各組細胞的生存率均達到了80％及以上。仍然具有較好的生物活性。細胞內吞實驗通過熒光顯微鏡和流式細胞儀進行。結果證實，經TTA1修飾的明膠-硅氧烷納米粒子較未經修飾的該納米粒腦膠質瘤細胞靶向性能優(yōu)越;再經陽離子多肽

6、TAT修飾后，各組納米粒子的透過細胞膜的能力均較前明顯增強，并且可以使攜帶的目的基因在細胞內高效的表達。
　　 3.通過辣根過氧化物酶（HRP）滲透實驗以及緊密連接蛋白ZO-1的免疫染色檢測，證實了可以利用商品化的人腦血管內皮細胞HCMEC/D3成功構建出良好的體外血腦屏障模型(BloodBrainBarriermodel，BBBM)。通過熒光光譜儀、熒光顯微鏡、化學發(fā)光儀等多種檢測方法證實，經TTA1和TAT修飾后的明膠硅氧烷