多肽介導腦膠質瘤靶向納米基因給藥系統(tǒng).pdf

1、腦膠質瘤是發(fā)病率最高的腦腫瘤，也是死亡率最高的10類腫瘤之一。由于腦膠質瘤自身的浸潤性生長特點以及血腦屏障(BBB)的存在，使得目前常用的治療手段包括手術切除、放療、化療等均難以達到良好的治療效果?；蛑委熓且环N極具潛力的治療手段，但是基因藥物難以自主向膠質瘤富集，需要構建具有主動靶向性質的基因藥物遞釋系統(tǒng)，使得外源性基因藥物在病灶部位實現(xiàn)廣泛表達。
　　本課題針對腦膠質瘤生長過程中BBB的生理特點，設想兩種構建基因藥物遞釋系統(tǒng)的

2、策略：(1)在腦膠質瘤晚期，BBB受到破壞，此時腦膠質瘤與其他腫瘤類似，具有EPR效應，在此基礎上采用膠質瘤靶向頭基修飾則能進一步提高藥物在膠質瘤細胞內的濃集；(2)在腦膠質瘤早期，BBB保持完整，選用對BBB、膠質瘤細胞高親和性多肽作為靶向頭基可能實現(xiàn)跨越BBB、靶向膠質瘤。
　　基于以上兩種策略，本課題通過藥劑學、高分子學和生物學手段的交叉應用，以陽離子高分子聚酰胺-胺(PAMAM)為基礎載體高分子，通過親水性高分子聚乙二醇(

3、PEG)連接膠質瘤靶向多肽CTX或BBB-膠質瘤雙靶向多肽Angiopep，與基因復合形成PAMAM-PEG-CTX/DNA和PAMAM-PEG-Angiopep/DNA納米粒。這兩種納米給藥系統(tǒng)具有以下特征：(1)所采用的基因載體PAMAM是近年發(fā)展起來的新型陽離子高分子材料，易于修飾，載基因能力較高；(2)選用的CTX是一段特異性與膠質瘤細胞結合的多肽，能提高納米粒的膠質瘤靶向性；(3)選用的Angiopep是一段與BBB和膠質瘤細

4、胞均具有高親合力的多肽，能夠協(xié)助納米粒穿越BBB后進一步向膠質瘤細胞濃集。
　　本文第一章對腦膠質瘤的生理特點及治療手段進行了概述。腦膠質瘤作為顱內最常見且最難治愈的疾病，除了具有一般腫瘤的基本特征外，還有自身的特點，主要表現(xiàn)為浸潤性生長和“韭菜樣”再生增殖的特點[1，2]。隨著腫瘤生成過程中腫瘤細胞與星形細胞以及內皮細胞的相互作用，血腦屏障逐漸受到破壞[3]。目前腦膠質瘤常用的治療手段包括手術切除、放療和化療，但是各自存在缺點且

5、療效不佳。基因治療是極具潛力的新型治療手段。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是最近發(fā)現(xiàn)的介導細胞凋亡的信號分子，具有TNF家族成員的許多特性[4]，能夠特異性與膠質瘤細胞表面受體結合誘導凋亡，但不殺傷正常細胞。本研究采用編碼TRAIL蛋白的質粒pORF-TRAIL作為基因藥物，以PAMAM為基礎載體，針對腦膠質瘤生長過程中BBB的生理特點，采取膠質瘤

6、靶向和BBB-膠質瘤雙靶向兩種策略構建出兩種基因藥物遞釋系統(tǒng)。分別選用CTX和Angiopep兩段多肽為靶向頭基，其中CTX能通過與膠質瘤細胞高量表達的基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)結合形成MMP-2-CTX復合物后被膠質瘤細胞特異性攝取，具有膠質瘤靶向作用[5]；而Angiopep則是通過膠質瘤細胞和BBB上均表達的低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)介導進入細胞[6]，從而實現(xiàn)BBB-膠質瘤雙靶向。
　　本文第二章第一節(jié)對PA

7、MAM-PEG-CTX高分子載體及其載基因納米粒的體外性質進行了評價。CTX修飾后能特異性增加載體高分子在C6膠質瘤細胞上的攝取，而在正常細胞(293細胞)上的攝取則不受影響。載體高分子在C6細胞上的攝取在4℃時受到抑制，說明載體可能通過內吞途徑進入細胞。CTX修飾后的載基因納米粒在C6細胞的攝取也明顯增加。
　　第二節(jié)考察了PAMAM-PEG-CTX/DNA載基因納米粒在荷腦膠質瘤小鼠的體內分布、腦內表達，并對納米粒治療腦膠質瘤

8、進行了藥效學評價。與未修飾的PAMAM/DNA納米粒相比，PAMAM-PEG-CTX/DNA能夠增加納米粒在荷腦膠質瘤小鼠腫瘤部位的聚集。冰凍切片結果顯示，PAMAM-PEG-CTX/DNA納米粒在膠質瘤邊緣部位的腫瘤組織有較明顯的表達，而PAMAM/DNA則在膠質瘤邊緣部位的正常組織部分有少量表達，這可能與腫瘤的新生血管與血腦屏障相關。藥效學評價結果顯示，PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL納米粒能夠誘導荷瘤小鼠腦膠質瘤內

9、部的腫瘤細胞凋亡，效果與市售的口服藥物替莫唑胺相當，而PAMAM/pORF-TRAIL則能在膠質瘤邊緣引發(fā)細胞凋亡；PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL和替莫唑胺組的荷瘤小鼠中位存活時間分別為59.5天和49天，且PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL組50％的小鼠存活時間超過70天，而替莫唑胺組的存活時間均小于70天。以上結果說明PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL能有效治療腦膠質瘤。
　　第三

10、章第一節(jié)對PAMAM-PEG-Angiopep高分子載體及其載基因納米粒的體內外性質進行了評價。Angiopep修飾后能夠增加載體在腦毛細血管內皮細胞(BCECs)上的攝取，并且在一定范圍內呈現(xiàn)出濃度依賴性。攝取機理考察結果顯示，PAMAM-PEG-Angiopep載體高分子及其載基因納米粒可能通過LRP介導的內吞途徑被BCECs攝取。Angiopep修飾后能提高載基因納米粒跨BCECs單層的轉運效率。體內分布結果顯示，Angiopep

11、修飾能增加載基因納米粒的腦內分布，且隨Angiopep修飾的比例上升而增加；同時，Angiopep的修飾能夠有效增加外來基因在小鼠腦內各部位的表達效率。PAMAM-PEG-Angiopep/DNA載基因納米粒顯示出良好的腦靶向效率。
　　第二節(jié)考察了PAMAM-PEG-Angiopep/DNA載基因納米粒在荷腦膠質瘤小鼠的體內分布，并對納米粒治療腦膠質瘤進行了藥效學評價。與未修飾的PAMAM/DNA納米粒相比，PAMAM-PEG-

12、Angiopep/DNA能夠增加納米粒在荷腦膠質瘤小鼠腫瘤部位的聚集，可能的原因是納米粒在Angiopep介導穿越BBB后進一步向膠質瘤細胞濃集，顯示出BBB-膠質瘤雙靶向作用。藥效學評價結果顯示，PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL納米粒能夠誘導荷瘤小鼠腦膠質瘤內部的腫瘤細胞凋亡；PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL和替莫唑胺組的荷瘤小鼠中位存活時間分別為56.5天和49天，二者的整體存活時