腦靶向載藥納米膠束治療膠質(zhì)瘤和耐藥性癲癇的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分,RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束靶向治療惡性膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:制備穩(wěn)定的(耐鹽、耐PH值變化)RGD-PIC,利用膠質(zhì)瘤細(xì)胞及動(dòng)物模型體內(nèi)、體外驗(yàn)證主動(dòng)免疫靶向技術(shù),為制備用于治療耐藥性癲癇的靶向載藥納米膠束提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:以馬來(lái)酰亞胺基單封端聚乙二醇(Mal-PEG-OH)為起始劑,采用主動(dòng)免疫靶向技術(shù)制備RGD多肽修飾的聚天冬氨酸離子復(fù)合物膠束(RGD-PIC)。通過(guò)體外培養(yǎng)的大鼠海

2、馬神經(jīng)元及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,CCK-8法檢測(cè)RGD-PIC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。制備量子點(diǎn)標(biāo)記的RGD-PIC,熒光顯微鏡觀察RGD-PIC的細(xì)胞分布情況。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系尾狀核立體定向注射法制備大鼠惡性膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型,外周給予RGD-PIC,結(jié)合量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù),觀察RGD-PIC對(duì)膠質(zhì)瘤的病灶靶向作用,免疫組織熒光染色分析RGD-PIC是否誘導(dǎo)了caspase-3的表達(dá),以及對(duì)正常腦組織區(qū)的影響。
　　結(jié)果:合成的RG

3、D-PIC表現(xiàn)為大小均一的納米結(jié)構(gòu),與U87細(xì)胞共培養(yǎng)后能聚集于細(xì)胞內(nèi),而對(duì)神經(jīng)元無(wú)此作用。RGD-PIC體外可抑制U87細(xì)胞的增殖,而對(duì)神經(jīng)元無(wú)影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,RGD-PIC特異性聚集于膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)區(qū),誘導(dǎo)了caspase-3表達(dá)增強(qiáng),對(duì)正常腦組織區(qū)無(wú)此影響。
　　結(jié)論:設(shè)計(jì)合成的RGD-PIC可體外選擇性殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞,體內(nèi)靶向作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞,并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分,多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp在耐藥性邊緣葉癲

4、癇模型大鼠中的表達(dá)及分布
　　目的:明確耐藥性癲癇大鼠與正常大鼠,非耐藥性癲癇大鼠相比,不同組織內(nèi)P-gp的表達(dá)差異.以及P-pg在不同器官內(nèi)的分布情況。
　　方法:利用苯妥英鈉自氯化鋁-匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇SD大鼠中篩選出耐藥性癲癇大鼠,結(jié)合westernblot、RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)正常、非耐藥性癲癇和耐藥性癲癇大鼠的海馬區(qū)、大腦皮層、間腦、肝臟、腎臟、小腸等部位P-gp的表達(dá)、分布情況。
　　結(jié)

5、果:耐藥性癲癇大鼠大腦海馬區(qū)、皮層P-gp表達(dá)顯著高于正常組及非耐藥性癲癇組(P<0.05)。耐藥性癲癇大鼠的腦內(nèi)海馬及皮層P-gp表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞,肝臟、腎臟及小腸的P-gp的微血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)P-gp表達(dá)。
　　結(jié)論:耐藥性癲癇大鼠的P-gp表達(dá)水平高于正?；蚍悄退幮园d癇大鼠。微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-gp的情況僅見(jiàn)于大腦皮層和海馬;分泌、吸收器官(肝臟、腎臟和小腸)的P-gp表達(dá)于血管外組織。P-gp可作為耐藥性癲癇靶向釋藥

6、的靶點(diǎn)。
　　第三部分,P-gp單克隆抗體修飾的苯妥因鈉米納米粒子的制備、表征及生物相容性
　　目的:利用納米材料獨(dú)特的表面效應(yīng),采用微納米粒子免疫靶向技術(shù)將P-gp單克隆抗體富集于共聚物納米粒子上,制備一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的外富P-gp單抗,內(nèi)集AEDs的新型微納米結(jié)構(gòu)(P-gpMAbNano-structuredmaterial,PNM)。并驗(yàn)證其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物相容性。
　　方法:以馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)或甲氧基封端的聚乙二

7、醇為起始劑,在辛酸亞錫做催化劑的情況下,合成單甲氧基封端的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(MePEG-PCL)兩嵌段共聚物和馬來(lái)酰亞胺基封端的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(Mal-PEG-PCL)兩嵌段共聚物。巰基化抗P-gp單克隆抗體,并合成PNM。透射電鏡觀察PNM的形態(tài)學(xué)特征。紅外譜圖分析和1HNMR譜圖分析合成物的基團(tuán)改變情況。DSL檢測(cè)PNM對(duì)不同pH值和不同鹽濃度的穩(wěn)定性。HPLC檢測(cè)PNM的釋藥情況。CCK-8法檢測(cè)PNM對(duì)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞

8、、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存率的影響。
　　結(jié)果:PNM為150nm-200nm的殼核狀納米粒子,在PH(7.3-8.5)范圍內(nèi),PNM的相對(duì)光強(qiáng)值保持在90％以上。PNM在0%的NaCl和0.9%NaCl溶液中的相對(duì)光強(qiáng)值分別為92.6%和91.6%,沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。HPLC測(cè)得其載藥量為21.45%,有近9小時(shí)的勻速釋放,在整個(gè)釋放過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象。5天內(nèi)50mg/L的PNM不影響腦微血管內(nèi)皮

9、細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元,但星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存率下降至88.90%,p<0.05。
　　結(jié)論:我們?cè)O(shè)計(jì)的PNM合成方案能順利制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)定PHT緩釋制劑PNM。PNM與神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物相容性較好,但對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存率有影響。存在進(jìn)一步改進(jìn)的空間。
　　第四部分,PNM治療耐藥性癲癇的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)我們?cè)O(shè)計(jì)、合成的PNM對(duì)耐藥性癲癇的靶向治療作用。
　　方法:體外

10、培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,給予無(wú)鎂處理及PNM處理,進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄電生理改變,CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元生存率的改變,ANNEXINV流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。分別用氯化鋁-匹魯卡品和最大電休克法誘導(dǎo)慢性海馬癲癇,苯妥因鈉篩選耐藥性癲癇大鼠。靜脈給予不同濃度的PNM,記錄腦電圖,微透析法取得大鼠腦脊液,HPLC檢測(cè)其PHT濃度,眼球取血,ELISA檢測(cè)TNF-α濃度。
　　結(jié)果:給予PNM100μg/ml干預(yù)72小時(shí)后,神經(jīng)元的癇

11、樣放電的其頻率和波幅均較對(duì)照組明顯減低,降為2-6次/min,且神經(jīng)元自身的EPSP也有明顯改善。給予20μg/mlPHT干預(yù)72小時(shí)后,神經(jīng)元生存率的變化情況與PNM組神經(jīng)元生存率的變化一致。PNM能使神經(jīng)元的凋亡比率從無(wú)鎂處理組的75.3%下降到無(wú)鎂+PNM組的30.2%,降低45.1%(p<0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,與PHT組相比,PNM能明顯改善耐藥性癲癇大鼠腦電圖中的異常表現(xiàn),提高腦內(nèi)PHT的濃度。PNM對(duì)耐藥性癲癇大鼠血液中

12、TNF-a影響較小。
　　結(jié)論:我們?cè)O(shè)計(jì)合成的PNM能體外抑制神經(jīng)元的癇樣放電,降低無(wú)鎂處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞生存率,效果與PHT無(wú)顯著差異;該P(yáng)NM顯著提升了PHT的腦內(nèi)釋藥,治療耐藥性癲癇的效果顯著優(yōu)于PHT,且對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響與PHT無(wú)異。結(jié)論:RGD修飾的RGD-PIC納米粒子可體外選擇性殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞,體內(nèi)靶向作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞,并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。P-gp可以作為耐藥性癲癇靶向釋藥的靶點(diǎn)分子。以P-gp單克