PLGA-CS雙層載藥陽離子納米粒治療腦膠質(zhì)瘤的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是臨床發(fā)病率最高的腦腫瘤，是威脅人類健康的主要疾病之一，具有高復發(fā)率和高死亡率的特點。由于腦膠質(zhì)瘤自身生長具有浸潤性以及血腦屏障(BBB)的存在，使得常規(guī)的治療方案包括手術切除、放療或化療均難以取得理想的治療效果。烷化劑類抗腫瘤藥物卡莫司?。–armustine，BCNU）通過將腫瘤細胞DNA鳥嘌呤上的第六位氧原子烷基化，促使DNA鏈間產(chǎn)生交聯(lián)，從而影響DNA復制。但是由于腫瘤細胞中存在DNA修復酶，尤其是O6-甲基鳥嘌呤-DN

2、A-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)，它可以將DNA鳥嘌呤上的烷基轉(zhuǎn)移到自身，修復腫瘤細胞，從而導致腫瘤細胞對BCNU產(chǎn)生耐藥性。O6-芐基鳥嘌呤(O6-Benzylguanine，BG)，通過直接消耗細胞中MGMT，達到有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對烷化劑耐藥性的作用。本課題以烷化劑BCNU為模型藥物、BG為抗腫瘤增敏劑，采用可生物降解的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和殼聚糖(

3、CS)為納米粒載體材料，制備核殼型雙層納米粒(PLGA/CS NPs)。以載有BCNU的PLGA為內(nèi)核，分散有BG的CS為外殼，通過外層BG的釋放，消耗腫瘤細胞中的MGMT，從而提高隨后釋出的BCNU抗腫瘤活性。
　　第一章的主要內(nèi)容是BCNU與其增敏劑BG的處方前研究。建立了BCNU與BG的HPLC分析方法;考察了BCNU在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，BCNU在水溶液中的穩(wěn)定性遠遠低于在有機溶劑中，且隨著pH值的增大和溫度的升

4、高而降低。以MGMT水平較低的C6細胞、MGMT水平較高的F98細胞和人原代膠質(zhì)母細胞（臨床病理診斷Ⅳ級，HPG）為腫瘤細胞模型，考察BG對BCNU細胞毒性的增敏作用。結(jié)果表明，BG可以提高C6、F98和HPG細胞對BCNU的敏感性，其增敏程度與腫瘤細胞本身MGMT表達水平有關。此外，BG的給藥濃度和給藥時間均對其增敏作用有一定影響。
　　第二章為(BCNU+BG)-PLGA/CS雙層納米粒的制備和表征。首先以粒徑、Zeta電位和

5、BCNU載藥量為指標進行單因素考察，包括PLGA分子量、PLGA濃度、CS分子量、CS濃度、表面活性劑、超聲功率、油相/水相體積比和除去有機溶劑方式等。確定主要影響因素后，通過正交試驗獲得優(yōu)化的處方和制備工藝。最優(yōu)處方制備得到(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒的粒徑為177.1±3.2 nm，Zeta電位為19.6±4.8 mV，BCNU載藥量為(3.05±0.32)％，BG載藥量為（8.97±0.81）％。(BCNU+BG)-P

6、LGA/CS納米粒的Zeta電位隨著溶劑pH值的增大而降低。透射電鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示，制得的納米粒呈清晰的核-殼雙層結(jié)構(gòu)，形態(tài)較圓整，大小均一。
　　第三章對PLGA/CS雙層納米粒進行了體外評價。血漿中穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明PLGA/CS納米粒中BCNU的降解半衰期延長至BCNU原藥的5倍。PLGA納米粒和PLGA/CS納米?？瞻纵d體的溶血毒性均較低。以C6、F98和HPG細胞為腫瘤細胞模型，考察載藥納米粒的細胞毒性。結(jié)果表明，載

7、藥納米粒組的細胞毒性均大于原藥組，其中同時載BCNU和BG的納米粒細胞毒性最強。在各給藥組中，F(xiàn)98細胞與HPG細胞不僅對BCNU具有相似的耐藥性，而且BG對兩種細胞的增敏效果也一致，因此選擇F98細胞作為耐藥腦膠質(zhì)瘤細胞模型，進行下一步體內(nèi)外評價。制備載熒光探針（香豆素6）的納米粒并進行表征，結(jié)果表明，載香豆素6的納米粒和載藥納米粒具有相近的粒徑和Zeta電位;此外，體外泄漏試驗結(jié)果表明，納米粒中香豆素6在24 h的體外泄漏率低于2％

8、，證明香豆素6是一種較為理想的熒光探針，可用于示蹤納米粒的體內(nèi)外行為。采用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察F98細胞對納米粒的攝取，結(jié)果表明，CS表面修飾可以顯著增強細胞對納米粒的攝取，而隨著納米粒粒徑的增大，攝取量降低，且細胞攝取呈時間依賴性。F98細胞對納米粒的攝取機理研究結(jié)果表明PLGA/CS納米粒主要通過與細胞膜表面的負電荷發(fā)生靜電作用，然后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導和細胞膜穴樣凹陷內(nèi)吞入胞。
　　第四章考察了熒光探針標記的PLGA/C

9、S雙層納米粒的體內(nèi)分布。香豆素6和BG載入PLGA/CS納米粒后在大鼠血漿中的滯留時間顯著延長，表現(xiàn)為AUC、t1/2β和MRT顯著增加。組織分布也發(fā)生顯著變化，特別是在腦組織，載入PLGA/CS納米粒后香豆素6和BG的AUC分別為對應溶液組的2.38倍和2.44倍;在腫瘤部位的AUC則分別提高了2.21倍和2.80倍。以上結(jié)果表明PLGA/CS納米粒改變了藥物的體內(nèi)行為。
　　第五章以F98荷瘤大鼠為模型，對(BCNU+BG)-

10、PLGA/CS納米粒進行藥效學和安全性評價。無論是游離藥物組還是納米粒組，BCNU聯(lián)合BG給藥后均能顯著延長荷瘤大鼠的生存時間，其中納米粒組平均生存時間和中位生存期最長，生存期延長率最大。相應地，通過MRI在體觀察各給藥組荷瘤大鼠的腫瘤生長情況，結(jié)果表明各給藥組均能不同程度地抑制腫瘤生長，其中(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒具有最強的抗腫瘤活性，該組荷瘤大鼠的平均腫瘤直徑最小。此外，通過體重測定和神經(jīng)學評分初步證明PLGA/CS

11、納米粒安全性較高。H&E染色和TUNEL法的結(jié)果表明，(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒組中腫瘤細胞對正常腦組織的浸潤度顯著降低，腫瘤細胞的凋亡明顯增加。
　　本課題構(gòu)建了同時裝載BCNU與BG的陽離子核殼型雙層納米粒(PLGA/CS NPs)，顯著延長了藥物在體內(nèi)的滯留時間，改善了藥物跨過BBB的能力，進而提高了藥物在腫瘤部位的蓄積。同時，一系列體內(nèi)外研究結(jié)果證明載BCNU和BG的PLGA/CS納米?？梢悦黠@增強BCNU的