iRGD修飾的PLGA-CS雙層載藥納米粒的初步研究.pdf

1、抗腫瘤烷化劑卡莫司汀(1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU）是臨床上治療腦膠質(zhì)瘤最常使用的化療藥物之一，但其臨床應(yīng)用中容易產(chǎn)生耐藥性，這與腫瘤細胞中O6_甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltrans-ferase，MGMT)的修復(fù)作用有關(guān)，O6-芐基鳥嘌呤(O6-benzylguanine，BG)能直接消耗細胞中的MGMT逆轉(zhuǎn)其耐藥性。本課

2、題組前期研究中采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了PLGA/CS雙層載藥納米粒，內(nèi)外層分別包載BCNU和BG兩種藥物，與BCNU原藥相比，顯著延長了藥物的體內(nèi)滯留時間，提高了跨血腦屏障(blood brain barrier, BBB)能力，增強了BCNU的抗腫瘤活性，但此納米粒遞藥系統(tǒng)中BG和BCNU先后釋藥行為不理想，靶向遞藥能力有待進一步提高。
　　許多腫瘤細胞（包括腦膠質(zhì)瘤細胞）以及其新生血管內(nèi)皮細胞表面都會高度表達αv.整合素，一種

3、名為“內(nèi)化RGD”(internalizing RGD，iRGD，CCRGDK/RGPDC)的環(huán)狀多肽，不僅與整合素具有較高的親和力，而且能夠通過腫瘤部位蛋白水解酶的作用，水解產(chǎn)生C端為RGDK/R序列的多肽片段，該多肽片段能進一步通過1-型跨膜糖蛋白（neuropilin-1，NRP-1）內(nèi)化進入腫瘤細胞。本課題擬制備一種iRGD修飾的主動靶向雙層納米粒遞藥系統(tǒng)，改進PLGA/CS雙層載藥納米粒的制備方法，并將目標(biāo)多肽連接在納米粒表面

4、，以期達到較高的抗腫瘤活性，并做更進一步考察。
　　課題在已建立的BCNU和BG分析方法基礎(chǔ)上，考察兩種藥物在不同條件下的穩(wěn)定性，同時對BCNU的細胞毒性以及BG對原藥的增敏作用進行了考察。結(jié)果顯示，溫度和pH對BCNU的穩(wěn)定性均有較大影響，在一定范圍內(nèi)降低溫度和pH能提高其穩(wěn)定性。細胞毒性實驗顯示，BG對C6、F98、U87三種腫瘤細胞均能起到顯著的增敏作用，程度與細胞中MGMT的表達水平有關(guān)。
　　本研究改用乳化溶劑分散

5、法(spontaneous emulsification solvent diffusionmethod，SESD)制備共載BCNU和BG的PLGA/CS納米粒，首先以粒徑、Zeta電位和BCNU的載藥量為指標(biāo)對PLGA分子量、PLGA濃度、PVA濃度和CS濃度等進行單因素考察，進而通過正交試驗獲得最優(yōu)處方。然后對納米粒中BCNU的穩(wěn)定性和體外釋放行為進行考察，并與本課題組掌握的乳化溶劑揮發(fā)法(emulsion-solvent evap

6、oration method，ESEM)制備的納米粒相比較。結(jié)果顯示，最優(yōu)處方制得納米粒粒徑為121.6±3.3 nm，Zeta電位為32.3±4.1 mV，BCNU和BG的載藥量分別為1.86±0.17％和6.82±1.15％，與原處方接近。體外穩(wěn)定性研究顯示，原納米粒與本納米粒表觀一級降解動力學(xué)常數(shù)k的比值為1∶8，本納米粒顯著提高了BCNU的穩(wěn)定性。體外釋放實驗顯示，4h時BG的釋放量已接近100％，而BCNU24h時的累積釋放量

7、未超過65％，說明BG能夠先于BCNU釋放，BCNU有良好的緩釋效果，達到預(yù)期目標(biāo)。
　　本研究采用雙功能基團聚乙二醇(Maleimide-polyethyleneglycol-N-Hydroxysuccinimide，MAL-PEG-NHS，MW2000)為間隙基將iRGD修飾在納米粒表面。即先將PEG與CS共價連接，同法制備PLGA/CS-PEG納米粒(PEG-NPs)，然后通過iRGD與PEG一端的馬來酰亞胺反應(yīng)與納米粒連接

8、制得iRGD-PEG-NPs。BCA顯色反應(yīng)和X射線光電子能譜(XPS)分析均證明多肽成功連接在了納米粒表面。對納米粒進一步表征結(jié)果顯示，PEG-NPs的粒徑、Zeta電位和載藥量分別為122.5±2.89 nm、32.7±6.66 mV和1.82±0.11％，與PLGA/CSNPs基本相同;而iRGD-PEG-NPs的粒徑、Zeta電位和載藥量分別為126.3±3.67nm、34.3±5.51 mV和1.50±0.04％，載藥量略低。

9、電鏡結(jié)果顯示，制得納米粒形態(tài)圓整，大小均一，具有核-殼型結(jié)構(gòu)。
　　分別對納米粒中BCNU在pH7.4 PBS和血漿中的穩(wěn)定性進行考察，BCNU、PEG-NPs和iRGD-PEG-NPs中BCNU在pH7.4緩沖液中表觀一級降解動力學(xué)常數(shù)k的比值為13.46∶1∶1.04，血漿中表觀一級降解動力學(xué)常數(shù)k的比值為18.39∶1∶1.13，表明納米粒在PBS和血漿中均能顯著提高BCNU的穩(wěn)定性。納米粒的體外釋放實驗顯示，PLGA/CS

10、 NPs、PEG-NPs和iRGD-PEG-NPs中BG在4h時的釋放量均接近100％，而BCNU在24 h時的累積釋放量均未超過68％，釋放行為基本相同。
　　以C6、F98和U87細胞為腫瘤細胞模型，采用MTT法考察載藥納米粒的細胞毒性。細胞毒實驗顯示，與原藥相比，載藥納米粒的細胞毒性均顯著高于原藥組，聯(lián)合應(yīng)用BG后對三種細胞的毒性分別提高了2.3、4.0和1.7倍左右，顯示了不同程度的增敏作用，iRGD多肽的修飾進一步提高了

11、細胞毒性。采用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀分別對納米粒的攝取行為進行了定性和定量考察。結(jié)果顯示，細胞攝取量隨納米粒濃度的增大而增大，連接多肽能顯著提高納米粒向腫瘤細胞的內(nèi)化攝取能力。進一步，以腫瘤球為模型體外考察納米粒滲透腫瘤的能力，結(jié)果顯示，多肽修飾納米粒的滲透腫瘤的能力顯著優(yōu)于普通納米粒。
　　本課題構(gòu)建了iRGD修飾的共載BCNU和BG兩種藥物的核-殼型納米粒。BG能夠先于BCNU釋放，BCNU具有良好的緩釋效果，納米粒顯著提