魚(yú)精蛋白包覆PLGA納米粒用于疫苗載體的初步研究.pdf

1、近年來(lái)，高分子材料聚乳酸羥基乙酸（PLGA）、聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸（PEG-PLGA）因具有良好的生物相容性和生物可降解性而作為多肽、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA 疫苗的載體，在疫苗載藥系統(tǒng)里成為了研究熱點(diǎn)。納米粒一般是指粒徑10～1000nm的顆粒，PLGA 納米粒包裹抗原在注射局部起到儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)并增強(qiáng)吞噬細(xì)胞攝取，而PEG-PLGA 納米粒則具有良好的透粘膜性能，可用于粘膜免疫疫苗的載體。目前研究表明，在高分子載體表面修飾陽(yáng)離子可以增強(qiáng)載體

2、的佐劑效應(yīng)以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。魚(yú)精蛋白（PS）是FDA 批準(zhǔn)使用的富含精氨酸的帶正電荷蛋白質(zhì)，魚(yú)精蛋白包覆的PLGA 微球作為疫苗載體可以有效誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化，但有關(guān)表面包覆魚(yú)精蛋白的PLGA 納米?；騊EG-PLGA 納米粒用于疫苗載體尚無(wú)研究報(bào)道。本研究采用魚(yú)精蛋白表面包覆PLGA、PEG-PLGA 納米粒，探討其對(duì)小鼠骨髓源性樹(shù)突細(xì)胞（BMDC）表型、BMdC攝取、BMdC細(xì)胞因子分泌及抗原交叉遞呈作用的影響。
　　

3、 完成的主要研究工作有：
　　 （1)復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備PLAG 納米粒和PEG-PLGA 納米粒，采用單因素方法以PLGA 為載體材料，以卵清白蛋白（OVA）為模型藥物，并以納米粒粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、表面電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，進(jìn)行制備處方的優(yōu)化篩選。當(dāng)藥物濃度為100 mg/mL，載體用量為50 mg/mL，內(nèi)水相與有機(jī)相體積比（W1/O）為1:5，有機(jī)相與外水相體積比(O/W2)為1:20，乳化劑PVA

4、濃度為0.5％，超聲乳化功率為600 W 時(shí)，制備的OVA-PLGA納米粒粒徑303.3±6.1 nm，Zeta 電位-7.36±1.02mV，PDI 0.113±0.031，包封率62.46±0.32％，載藥量23.80±0.09％；OVA-PEG-PLGA納米粒粒徑271.4±9.2 nm，Zeta 電位-6.04±0.23 mV，PDI 0.311±0.032，包封率61.51±2.9％，載藥量23.51±0.85％。用魚(yú)精蛋白分

5、別與制備得到的PLGA 納米粒和PEG-PLGA 納米粒共同攪拌進(jìn)行表面物理包覆，得到魚(yú)精蛋白包覆的OVA-PLGA 納米粒（OVA-PLGA/PS）粒徑347.0±10.6 nm，Zeta 電位8.01±1.05 mV，PDI 0.144±0.034；魚(yú)精蛋白包覆的OVA-PEG-PLGA 納米粒（OVA-PEG-PLGA/PS）粒徑341.2±55.8 nm，Zeta 電位8.48±3.42 mV，PDI 0.165±0.080。在

6、透射電鏡觀察時(shí)，各種納米粒形態(tài)規(guī)整，分散性好。以上包裹OVA的納米粒主要用于研究BMdC吞噬納米粒后表型變化、細(xì)胞因子分泌和交叉遞呈實(shí)驗(yàn)。本研究還按照不同研究目的制備了用于研究BMdC攝取的FITC-OVA-PLGA、FITC-OVA-PEG-PLGA、FITC-OVA-PLGA/PS和FITC-OVA-PEG-PLGA/PS 納米粒；用于研究BMdC攝取后細(xì)胞內(nèi)分布的OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA、OsO4-PLGA/

7、PS和OsO4-PEG-PLGA/PS納米粒，其Zeta 電位在包覆魚(yú)精蛋白后均呈由負(fù)到正的轉(zhuǎn)變。
　　 （2)分離、誘導(dǎo)分化BMdC并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和表型的鑒定，結(jié)果顯示在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素4（IL-4）聯(lián)合刺激的作用下，骨髓干細(xì)胞成功分化為BMDC，其純度為85～95％（CD11c+）。BMdC培養(yǎng)體系的成功建立為實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展提供了重要保障。本研究觀測(cè)了前述各種納米粒對(duì)BMDC表面分子（C

8、D80、CD83、CD86、MHC I、MHC II）表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS可以顯著促進(jìn)BMDC表面分子表達(dá)水平的增高，而OVA-PEG-PLGA/PS 可顯著促進(jìn)除CD80之外的BMDC表面分子表達(dá)。研究了前述各種納米粒對(duì)BMDC分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-12p70的作用，發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS 可以顯著增加BMDC分泌IL-12p70 并顯著減少分泌IL-4，而OVA-PEG-PLGA/PS 可以顯

9、著增加BMDC分泌IL-4。以上結(jié)果表明，PS 包覆對(duì)不同高分子納米?？赡芷鸬讲煌拇碳MDC的作用。對(duì)PLGA 納米粒而言，PS 包覆可以促進(jìn)其誘導(dǎo)BMDC分泌Th1 極化細(xì)胞因子（IL12p70），而對(duì)PEG-PLGA 納米粒而言，PS 包覆主要促進(jìn)其誘導(dǎo)BMDC分泌Th2極化細(xì)胞因子（IL-4）。
　　 （3)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究了BMdC對(duì)包裹FITC 偶聯(lián)OVA 各種納米粒的攝取特征。發(fā)現(xiàn)魚(yú)精蛋白包覆的PLGA 納米粒

10、（FITC-OVA-PLGA/PS、FITC-OVA-PEG-PLGA/PS）可以顯著增強(qiáng)BMDC的攝取，且FITC-OVA-PLGA/PS 對(duì)攝取的促進(jìn)作用更加顯著。這種攝取在37 ℃條件下，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，呈時(shí)間依賴性，但在低溫（4 ℃）時(shí)，攝取增加不明顯，說(shuō)明魚(yú)精蛋白包覆納米粒的攝取方式為能量依賴性的內(nèi)吞方式。
　　 （4)通過(guò)將高電子密度的OsO4 包裹入PLGA、PEG-PLGA 納米粒內(nèi)，表面包覆（OsO4-PLG

11、A/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS）或不包覆魚(yú)精蛋白（OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA），并使用透射電鏡觀測(cè)經(jīng)BMdC攝取后，納米粒在BMdC內(nèi)細(xì)胞器的分布。
　　 研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)精蛋白包覆的納米粒（OsO4-PLGA/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS）正在和BMdC吞噬囊泡壁接觸；而未用魚(yú)精蛋白包覆的納米粒（OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA）則未觀察到與BMdC吞噬囊泡相互作用的現(xiàn)象。表明

12、魚(yú)精蛋白包覆可能通過(guò)促進(jìn)納米粒與BMdC吞噬囊泡膜的相互作用而促使納米粒的溶酶體逃逸。
　　 （5)通過(guò)CD8+T細(xì)胞B3Z T 雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行BMdC對(duì)納米粒包裹OVA的交叉遞呈作用的研究。著重研究了魚(yú)精蛋白包覆納米粒（OVA-PLGA/PS和OVA-PEG-PLGA/PS）對(duì)BMdC交叉遞呈的影響，發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS的促進(jìn)能力最強(qiáng)。此外，考察了魚(yú)精蛋白包覆納米粒在不同劑量、不同孵育時(shí)間下對(duì)BMdC交叉遞呈的影響，發(fā)現(xiàn)

13、OVA-PLGA/PS 在濃度50～300 μg/mL、孵育時(shí)間2～8 h 內(nèi)對(duì)BMdC交叉遞呈的影響分別呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性；而OVA-PEG-PLGA/PS 在濃度50～400 μg/mL、孵育時(shí)間2～10 h 內(nèi)對(duì)BMdC交叉遞呈的影響分別呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明魚(yú)精蛋白包覆的納米粒（PLGA/PS、PEG-PLGA/PS）可以增加BMdC吞噬、促進(jìn)BMdC成熟、刺激BMdC細(xì)胞因子分