攜帶tPA真核表達(dá)載體PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體的構(gòu)建及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分:pIRES-tPA-Dsred Express-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和體外表達(dá)
　　目的:構(gòu)建攜帶有組織型纖溶酶原激活因子目的片段的真核表達(dá)載體pIRES-tPA-Dsred Express2。驗(yàn)證該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 EA.hy926是否高表達(dá)組織型纖溶酶原激活因子,其產(chǎn)物蛋白是否具有生物學(xué)活性。
　　方法:勾取 tPA基因的CDS序列,通過基因工程技術(shù)將其插入

2、 pIRES-Dsred Express2質(zhì)粒,構(gòu)建攜帶有人組織型纖溶酶原激活因子目的片段的真核表達(dá)載體pIRES-tPA-Dsred Express2。將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體 pIRES-tPA-Dsred Express2用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 EA.hy926。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí),細(xì)胞內(nèi)目的蛋白 mRNA含量;Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后相

3、關(guān)蛋白表達(dá)情況;應(yīng)用ELISA技術(shù),檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中tPA含量;應(yīng)用酶促反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中人組織型纖溶酶原激活因子活性。觀察轉(zhuǎn)染 pIRES-tPA-Dsred Express2載體后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 EA.hy926對(duì)于人組織型纖溶酶原激活因子及其相關(guān)蛋白分泌及其活性隨時(shí)間的變化關(guān)系。
　　結(jié)果:通過將 tPA目的基因片段插入 pIRES-Dsred Express2質(zhì)粒,成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體 pIRES-tPA-Ds

4、red Express2。體外轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926后48小時(shí)可以觀察到細(xì)胞可激發(fā)紅色熒光,轉(zhuǎn)染效率為(20.7±4.2)％。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)顯示 pIRES-tPA-Dsred Express2質(zhì)粒組其 tPA,Dsred的mRNA相對(duì)含量分別為769.21±35.11及1164.26±82.85,顯著高于對(duì)照組。Western Blot檢測(cè)顯示,目的蛋白 tPA及紅色熒光蛋白 Dsred含量顯著增高。細(xì)胞上

5、清人組織型纖溶酶原激活因子含量及人組織型纖溶酶原激活因子活性檢測(cè)顯示pIRES-tPA-Dsred Express2質(zhì)粒組(4.73±0.02) ng/hour·(105cells),活性為(9.48±0.12)IU/hour·(105cells),顯著高于對(duì)照組。轉(zhuǎn)染 pIRES-tPA-Dsred Express2后內(nèi)皮細(xì)胞上清中的人組織型纖溶酶原激活因子濃度及活性在24小時(shí)為最高,而后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。人組織型纖溶酶原激活因子活性變化

6、受纖溶酶原激活物抑制劑-1影響與其濃度變化方式不同。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶有人組織型纖溶酶原激活因子的真核表達(dá)載體pIRES-tPA-Dsred Express2。體外轉(zhuǎn)染驗(yàn)證其可正確指導(dǎo)合成及分泌組織型纖溶酶原激活因子,表現(xiàn)出顯著纖溶活性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分:超聲微泡介導(dǎo) pIRES-tPA-Dsred Express2-脂質(zhì)體復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染及表達(dá)
　　目的:通過超聲微泡介導(dǎo)的基因治療技術(shù)將

7、攜帶有組織型纖溶酶原激活因子基因的質(zhì)粒 pIRES-tPA-DsRed-Express2-脂質(zhì)體復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,使內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)組織型纖溶酶原激活因子,觀察超聲介導(dǎo)的基因治療技術(shù)對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果。
　　方法:薄膜水化制備全氟丙烷超聲微泡。使用全氟丙烷微泡介導(dǎo)pIRES-tPA-DsRed-Express2-脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系 EA.hy926細(xì)胞。通過熒光計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光

8、定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí),細(xì)胞的目的蛋白 mRNA含量;應(yīng)用ELISA技術(shù),檢測(cè)上清中tPA含量及活性。
　　結(jié)果:制備的全氟丙烷超聲微泡平均大小為(3.5±1.4)μm。微泡濃度為(3.3±1.2)×108/ml。zeta電位為(-2.2±1.5)mV。制備后的12小時(shí)內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),超聲微泡介導(dǎo)組(UM+LTX)轉(zhuǎn)染效率為(27.3±3.6)％, Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染組(LTX)轉(zhuǎn)染效率為

9、(20.6±2.0)％。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)顯示 UM+LTX組及LTX組,目的蛋白 tPA的mRNA的相對(duì)含量分別為(953.15±92.77)和(721.32±68.31),具有顯著性差異。熒光蛋白 Dsred的mRNA相對(duì)含量分別為(1191.22±109.31)和(1092.15±102.71)。UM+LTX組其細(xì)胞上清中的tPA含量及tPA活性均較 LTX顯著升高。
　　結(jié)論:成功制備了含有全氟丙烷的超聲微泡。

10、通過超聲微泡介導(dǎo)質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞 EA.hy926,進(jìn)一步提高了質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,從而提高目的蛋白組織型纖溶酶原激活因子的表達(dá)分泌量,提高了纖溶活性。
　　第三部分:攜帶可表達(dá) tPA真核表達(dá)載體 PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體的構(gòu)建及體外吞噬實(shí)驗(yàn)
　　目的:構(gòu)建攜帶有可表達(dá)組織型纖維溶酶激活因子質(zhì)粒的PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體。檢測(cè)其理化性質(zhì),體外緩釋方式,細(xì)胞毒效應(yīng)及其在超聲介導(dǎo)

11、下對(duì)于細(xì)胞攝取納米粒的影響。
　　方法:應(yīng)用雙次乳化法制備攜帶有 pIRES-tPA-DsRed Express2質(zhì)粒的PLGA納米粒;應(yīng)用薄膜水化超聲法制備陽離子超聲微泡;兩者通過靜電吸附的方式形成 PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體。檢測(cè) PLGA納米粒的載藥量,PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體質(zhì)粒載量;檢測(cè)納米粒及納米粒-超聲微泡復(fù)合體細(xì)胞毒性;檢測(cè)PLGA納米粒及PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體體外緩釋質(zhì)粒的方式;檢測(cè)其在超聲輻照

12、介導(dǎo)的微泡解構(gòu)時(shí)介導(dǎo)體外細(xì)胞吞噬納米粒的能力。
　　結(jié)果:自制的納米粒其粒徑為(217.2±2.2)nm,zeta電位為(-15.24±0.83) mV。微泡平均大小為(3.2±1.5)μm,Zeta電位為(13.66±2.05)mV。微泡濃度為(4.3±1.1)×108/ml。納米粒-超聲微泡復(fù)合體其平均大小為(4.6±1.7)μm。zeta電位為(2.23±1.45)mV。濃度為(3.0±1.3)×108/ml。1mgPLGA

13、納米粒載有質(zhì)粒(42.3±2.1)μg。1ml納米粒-超聲微泡復(fù)合體中帶有質(zhì)粒(20.5±2.7)μg。納米粒及納米粒-超聲微泡復(fù)合體均表現(xiàn)為在起始段短時(shí)內(nèi)質(zhì)?？焖籴尫?后呈現(xiàn)穩(wěn)定釋放的趨勢(shì)。到達(dá)第7天時(shí),釋放量達(dá)到其總量的(57±3)％。納米粒及納米粒-超聲微泡復(fù)合體均未見明顯細(xì)胞毒性效應(yīng),僅最高濃度組見輕度的細(xì)胞活性減少。PLGA納米粒組及PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體組均可見大量的納米粒被吞噬。PLGA納米粒-超聲微泡復(fù)合體組在超