大鼠EGF、CNTF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外表達(dá).pdf

1、目的:分別構(gòu)建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表達(dá)質(zhì)粒,并檢測其在cos-7細(xì)胞中的共表達(dá),為下一步進(jìn)行基因治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:①pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:3周齡SD大鼠一只脫頸處死后,在無菌、無RNA酶污染、冰冷的條件下利用Trizol試劑提取出大鼠頜下腺及坐骨神經(jīng)組織

2、總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別擴(kuò)增出EGF及CNTF基因功能片段,電泳分析結(jié)束后回收純化PCR產(chǎn)物,回收產(chǎn)物分別與空白質(zhì)粒pSecTag2/Hygro B同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和Hind雙酶切,兩組酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶作用后,分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109,LB瓊脂平板培養(yǎng)過夜。經(jīng)PCR初篩,兩組陽性克隆分別行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,測序結(jié)果使用BLAST軟

3、件與GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析。
　　②cos-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組大鼠EGF、CNTF蛋白的表達(dá)及檢測:取純化的重組質(zhì)粒pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF,在脂質(zhì)體試劑LipofectamineTM2000的作用下分別單獨(dú)及共轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后分別收集三組細(xì)胞培養(yǎng)液,Western blot鑒定重組EGF、CNTF蛋白在cos-7細(xì)胞各組中的表達(dá)情況。

4、>　　結(jié)果:①逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)成功獲得大鼠EGF及CNTF cDNA功能片段。隨機(jī)挑選兩組各10個(gè)重組真核表達(dá)載體的克隆,聚合酶鏈反應(yīng)篩選出兩組陽性克隆各2個(gè),經(jīng)雙酶切鑒定、測序及Blast分析鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　②兩種質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別單獨(dú)及共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞48h后,Western blot鑒定重組EGF、CNTF蛋白在三組cos-7細(xì)胞中的表達(dá),分別在6kDa和22kDa處出現(xiàn)陽性條帶。
　　結(jié)論: