治療性抗體通用真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景 惡性腫瘤嚴(yán)重危害人們的健康，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，在全世界50多億人口中平均每年死于惡性腫瘤者達(dá)690萬人，新發(fā)病例為870萬例，且數(shù)字還在逐年增加。在我國(guó)，根據(jù)衛(wèi)生部2004年公報(bào)資料，2003年惡性腫瘤仍穩(wěn)居我國(guó)部分市縣疾病死因之首。 淋巴瘤起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織，分為霍奇金病(Hodgkindisease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma,NHL)兩大類，其中以B淋巴細(xì)胞最為常見。

2、 在本篇論文中主要涉及到B細(xì)胞性非何杰金氏淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤是一種常見的惡性淋巴腫瘤，治療非何杰金氏淋巴瘤有很多常規(guī)方法，以放療和化療為主，但放療和化療毒副作用大且選擇性不強(qiáng)，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也有毒害作用，而且很容易產(chǎn)生內(nèi)在性或獲得性多藥耐藥(Multi-drugresistance，MDR)和復(fù)發(fā)，并且對(duì)中度和高度惡化的B-cellNHL的緩解率很低。因此只殺傷腫瘤細(xì)胞而正常細(xì)胞不受損害的靶向治療一直

3、受到關(guān)注。單克隆抗體因其特異性高，本身具有細(xì)胞毒作用，可攜帶藥物，毒物和放射性同位素而成為靶向治療的主要策略。 目前腫瘤的單克隆抗體導(dǎo)向治療是一個(gè)研究十分活躍的領(lǐng)域，且取得了可喜的成果。對(duì)非霍奇金淋巴瘤(NHL)的單克隆抗體導(dǎo)向治療就是一個(gè)較為成功的例子，目前臨床治療效果最好的還是抗CD20抗體。 但由于抗體片段Fab'及F(ab')2是抗原結(jié)合活性片段，缺少Fc段細(xì)胞生物學(xué)功能，且Fab'及F(ab')2的分子量較小，

4、因此血漿半衰期比較短，影響了它的療效。 目的 本實(shí)驗(yàn)主要構(gòu)建用于表達(dá)治療B淋巴細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤的抗CD20基因工程抗體的真核表達(dá)載體。研制的該抗體片段已擁有我國(guó)獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)，與國(guó)外同類產(chǎn)品相比有以下優(yōu)勢(shì)：基因工程抗體片段誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng)；與CD20抗原結(jié)合的表位不同，可能在抗B-cellNHL耐藥方面更具有優(yōu)勢(shì)，研制成功后有望取代國(guó)外同類產(chǎn)品。真核表達(dá)載體的優(yōu)勢(shì)在于：真核中抗體蛋白可正確折疊和糖基化，產(chǎn)生更接

5、近人的結(jié)構(gòu)分子，將有更好的活性；因?yàn)槿勾蠓肿釉谠酥挟a(chǎn)量較低，因此在真核表達(dá)，相對(duì)于原核，產(chǎn)量將有所提高。 研究方法 主要通過基因工程及分子生物學(xué)方法，采用PCR手段，分別合成全抗體的輕鏈和重鏈，通過限制性內(nèi)切酶酶切，利用5'和3'的黏性末端，連接等方法，將抗體片段導(dǎo)入真核表達(dá)載體質(zhì)粒PEE14中，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有amp的瓊脂糖凝膠的平板上，過夜生長(zhǎng)然后通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定出含有導(dǎo)入質(zhì)粒的陽性菌株，

6、交由生物公司測(cè)序。然后通過構(gòu)建的分別含有抗CD20全抗體輕鏈和重鏈的PEE14質(zhì)粒，通過多克隆接頭，改造PEE14質(zhì)粒，消除SalI位點(diǎn)，加入notI位點(diǎn)，然后通過中間載體pcdna3.1，將輕鏈和重鏈基因同時(shí)轉(zhuǎn)入同一真核表達(dá)載體PEE14中。 結(jié)果 構(gòu)建了分別含有抗CD20全抗體輕鏈和重鏈的PEE14質(zhì)粒； 改造了pcdna3.1過渡載體，去掉了一個(gè)SalI位點(diǎn)，加入了NotI位點(diǎn)。 構(gòu)建了抗CD20全