人生長(zhǎng)激素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá).pdf

1、目的 人生長(zhǎng)激素(humangrowthhormone，hGH)是由人腦垂體前葉分泌的一種多肽，可促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及免疫功能，對(duì)機(jī)體的各個(gè)器官和各種組織均有影響，尤其對(duì)骨骼、肌肉及內(nèi)臟器官的作用更為顯著[1】。hGH基因位于第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂【2]，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子以及3’末端、5’末端的不翻譯序列，跨度為26kb。人生長(zhǎng)激素是由hGH基因先翻譯為激素原，然后經(jīng)酶解將217個(gè)氨基酸的前生長(zhǎng)素切去26個(gè)氨基酸的

2、前肽轉(zhuǎn)變而成[3，4】。人生長(zhǎng)激素是一條單鏈，含有191個(gè)氨基酸的親水性球蛋白，分子量為21．7KDa[1,3,5,6,7]。 最近研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)激素缺乏癥遠(yuǎn)比我們過(guò)去認(rèn)為的更加普遍[8】。成人生長(zhǎng)激素缺乏癥是一種非常獨(dú)特的疾病，它對(duì)心血管危險(xiǎn)因子有一定的影響(如引起高脂血癥、降低纖維蛋白溶解作用、發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的概率增加)，使心臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變，增加了,~lfil．管疾病的罹患率，并可使機(jī)體發(fā)生畸形構(gòu)建(降低機(jī)體肌

3、肉量、增加脂肪含量、使細(xì)胞外水分減少)，身體活動(dòng)能力下降，損害骨骼的強(qiáng)度，區(qū)域性骨礦物質(zhì)密度下降[9]；兒童生長(zhǎng)激素缺乏還可以導(dǎo)致侏儒癥[10】。總之，生長(zhǎng)激素缺乏是一種危害人類(lèi)健康的不可小覷的疾病。 研究證明牛生長(zhǎng)激素對(duì)人類(lèi)無(wú)效，而從尸體中獲得的人生長(zhǎng)激素的量少且用于臨床治療時(shí)可使Creutzfeldt-Jacob病的患病率增高…，[11,12】，自從運(yùn)用重組DNA技術(shù)將人生長(zhǎng)激素基因在大腸埃希菌中表達(dá)以來(lái)【13】，重組人生長(zhǎng)

4、激素在臨床中就有著廣泛的應(yīng)用。對(duì)生長(zhǎng)激素缺乏癥的兒童來(lái)說(shuō)，用重組人生長(zhǎng)激素進(jìn)行替代治療效果顯著，其可以使患者成年終身FAH高最接近遺傳靶身高【14】；在治療成人生長(zhǎng)激素缺乏癥能夠逆轉(zhuǎn)典型的代謝和改變機(jī)體成分(如它能明顯提高肌肉量，腰椎及骨礦物質(zhì)密度和載脂蛋白A1濃度，從而是脂肪含量下降，胰島素耐受性降低)㈣。在非生長(zhǎng)激素缺乏癥的矮身材中運(yùn)用重組人生長(zhǎng)激素亦有積極作用。此外，重組人生長(zhǎng)激素在心肌病，肝硬化，慢性腎功能衰竭、感染性疾病、燒傷

5、和艾滋病患者消耗期中都起重要作用[16-26]。 本研究中將克隆的人生長(zhǎng)激素插入到含有綠色熒光蛋白基因的真核表達(dá)載體pcDNA3．1(pcGFP)中，構(gòu)建真核質(zhì)粒pcGFP-GH。構(gòu)建成功的pcGFP-GH表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞系，以原位雜交技術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)人生長(zhǎng)激素和綠色熒光蛋白在成纖維細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。 材料和方法： 1．載體pcGFP-GH的構(gòu)建：

6、以含hGH的質(zhì)粒Wap2hGH為模板，設(shè)計(jì)引物(上下游引物分別有HindlII和BamHI酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增hGH的DNA片段，以HindIII和BamHI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收1．5kb酶切片段。以HindlII和BamHI雙酶切質(zhì)粒pcGFP，瓊脂糖凝膠電泳回收6．8kb酶切片段。HindIII和BamHI粘性末端互補(bǔ)。以T4連接酶連接1．5kbhGH的目的片段和6．8kbpeGFP質(zhì)粒DNA片段，16~C，連

7、接過(guò)夜。重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)TGI細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化菌涂于含Amp的LB培養(yǎng)皿上，37~C，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選6個(gè)克隆，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37~C，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。小提質(zhì)粒，分別進(jìn)行HindIII單酶切，Bam_HI單酶切以及HindIII和BamHI雙酶切鑒定。構(gòu)建成功的載體命名為pcGFP-GH一 2．載體pcGFP-GH的瞬時(shí)表達(dá)鑒定：以隨機(jī)引物法地高辛標(biāo)記hGHDNA探針，一20~C保存。將表達(dá)載體pcGFP-GH與脂質(zhì)

8、轉(zhuǎn)染胺試劑LipofectamineTM2000混合轉(zhuǎn)染NIH一3T3細(xì)胞，培養(yǎng)36小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞滴片，一20~C保存。采用原位雜交技術(shù)，以地高辛標(biāo)記hGHDNA探針檢測(cè)hGH在細(xì)胞滴片上的表達(dá)。 結(jié)果： 1陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcGFP-GH單酶切，瓊脂糖電泳顯示為8．3kb條帶；HindlII和BamHI雙酶切，顯示為1．5kb和6．8kb條帶。 2脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑Lipofectami