豬生長激素(pGH)的基因克隆及其畢赤酵母(Pichia pastoris)真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、生長激素(GH)生理功能非常廣泛，它幾乎可以影響到機體所有類型的組織器官，包括骨、軟骨、脂肪組織、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、腦組織和造血系統(tǒng)。本研究從40日齡的長白豬腦垂體中克隆了豬生長激素(pGH)基因，用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達了重組豬生長激素，并研究了表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性。主要有以下研究結(jié)果：
　　 1.摘取40日齡的長白豬腦垂體，從中提取總RNA，經(jīng)過RT-PCR擴增，得到了豬生長激素(pGH)基因編碼序列(Acession

2、N0.JF742642)。DNA電泳結(jié)果顯示，其條帶分子量大小與理論值651 bp相符，測序結(jié)果表明，其核苷酸序列與Genebank報道的目的基因100％相似，證實已經(jīng)正確克隆pGH目的基因。
　　 2.根據(jù)酵母真核表達載體特征重新設(shè)計引物，克隆獲得pGH基因的成熟肽編碼序列(570 bp)，定向插入畢赤酵母真核表達載體pPICZαA和pGAPZαA。DNA測序結(jié)果表明重組表達載體pPICZαA-pGH和pGAPZαA-pGH連

3、接方向正確，且序列沒有發(fā)生移碼。將此重組表達載體線性化后通過電擊轉(zhuǎn)化至GS115酵母感受態(tài)細胞，用含有Zeocin的YPD培養(yǎng)基篩選重組子，提取鑒定酵母基因組，PCR擴增電泳鑒定的結(jié)果可以看出重組酵母GS115基因組以特定基因引物擴增出586 bp左右的條帶與理論的結(jié)果相符，以通用引物擴增的1100 bp左右及1040 bp左右的條帶也均符合理論值，說明重組酵母菌構(gòu)建成功。
　　 3.將鑒定的陽性重組酵母用不同濃度的Zeocin

4、(基本濃度100μg/mL)抗性平板篩選多拷貝子，結(jié)果顯示隨著Zeocin濃度的提高，重組酵母的生長狀況呈遞減趨勢，能夠在較高抗性濃度(Zeocin濃度>1200μg/mL)平板上較好生長的重組酵母為編號P14的pPICZαA-pGH-GS115重組酵母和編號為G1400，G2400，G3400，和G4400的pGAPZαA-pGH-GS115重組酵母，選取用于進行蛋白表達。
　　 4.高抗Zeocin的重組酵母菌株進行培養(yǎng)表達

5、目的蛋白。高抗菌株pGAPZαA-pGH-GS115 G1400、G2400、G3400和G4400的表達分泌上清液SDS-PAGE結(jié)果顯示，其蛋白表達量均高于陽性對照，且G2400在26 KD處可見與理論分子量大小相符的目的蛋白。相應(yīng)的Western-blot結(jié)果也顯示，G1400，G2400，G3400和G4400均在26 KD處有特異性條帶出現(xiàn)。
　　 5.高抗重組菌pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pG

6、H-GS115接種培養(yǎng)，在不同時間取樣，SDS-PAGE分析顯示，隨著時間的推移，pGAPZαA-pGH-GS115和pPICZαA-pGH-GS115的pGH表達量均在96 h最高，在120 h反而降低，說明96 h是較為理想的分泌上清收集時間。且相對應(yīng)的Western-blot分析顯示，26KD左右均出現(xiàn)特異性條帶，與理論大小相符。
　　 6.將96 h收集的高產(chǎn)菌株的分泌上清經(jīng)過Ni++柱親和純化以獲得目的蛋白的純化樣品。

7、純化結(jié)果SDS-PAGE分析顯示，pPICZαA-pGH-GS115分泌上清用Elution buffer洗脫收集的蛋白樣E1，E2，E3均有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，且E1中濃度最高，選為下一步活性分析的樣品。pGAPZαA-pGH-GS115分泌上清的目的蛋白在E2和E3中比較集中，且E2的濃度最高，選為下一步活性分析的樣品。豬生長激素蛋白純化樣品和標(biāo)準(zhǔn)BSA對照，計算出純化收集的pGH濃度均約為8 mg/L左右。
　　 7.將選