水貂生長(zhǎng)激素真核重組質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)的研究.pdf

1、本試驗(yàn)旨在研究水貂生長(zhǎng)激素的克隆與表達(dá)，探索出批量生產(chǎn)的途徑和方法。試驗(yàn)通過構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mGH，轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115，利用含不同濃度G418(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)的YPD平板進(jìn)一步篩選多拷貝重組子。將多拷貝重組子用BMGY富集菌株，并用BMMY誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，每隔24h取樣一次并添加甲醇，使其終濃度為1％。將取得的菌樣，離心取上清，TCA濃縮并進(jìn)行SDS-PAGE和We

2、stern blot檢測(cè);通過構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-mGH，利用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，用最小致死量為300μg/ml的G418進(jìn)行陽性細(xì)胞株的篩選，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。本試驗(yàn)還將陽性重組質(zhì)粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四頭肌，分別于注射后5、10、20、40、60d眼球采血，ELISA檢測(cè)血清中mGH的含量，同時(shí)取注射部位的肌肉組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)

3、。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.重組質(zhì)粒pPIC9K-mGH轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經(jīng)含4.00 mg/mlG418的YPD平板篩選出高拷貝細(xì)胞株，用SDS-PAGE檢測(cè)mGH的表達(dá)。結(jié)果顯示，用1％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)3d后，目的蛋白的表達(dá)最多;Western blot鑒定表明目的蛋白在酵母中獲得了表達(dá)。
　　 2.重組質(zhì)粒pVAX1-mGH轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物BHK-21細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選出陽性細(xì)胞株，免疫組化檢測(cè)到目的