PEDVN基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及其對Vero細胞的影響.pdf

1、目前在全世界范圍內(nèi)流行并給許多養(yǎng)豬戶造成嚴重經(jīng)濟損失的疾病當中，豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)占有絕對地位，它是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬的急性、熱性、高度接觸性腸道傳染病，PEDV屬冠狀病毒科中的α冠狀病毒，感染該病的豬常表現(xiàn)出體溫一般正常、強烈嘔吐、水樣腹瀉等特點，仔豬和育肥豬感染后發(fā)病率接近100％，仔豬死亡

2、率通常在一半以上，成年母豬發(fā)病率在20％左右，一般可耐過;PED的傳播速度較慢，在控制不及時的情況下一般在一個月之內(nèi)傳遍全場。幾乎所有冠狀病毒中，N蛋白在疾病診斷與防治、致病機制的研究等方面都發(fā)揮著重要作用，因為冠狀病毒的N蛋白具有一些特殊的功能，如可引起機體最早期的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染初期機體便可產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體，為疾病的診斷以及疫苗的研制提供有利條件;N蛋白氨基酸序列中含有特殊的亞細胞定位信號，且在不同病毒種類中此序列不同，

3、可根據(jù)此信號研究N蛋白在宿主細胞中的定位特征，為冠狀病毒致病機制的研究提供了可能。本實驗以PEDV N蛋白為研究對象，構(gòu)建N基因的重組真核質(zhì)粒，對表達的重組N蛋白進行檢測，并對N蛋白的亞細胞定位特征進行研究，以期為PEDV的早期診斷方法的建立及致病機制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本實驗主要從以下四個方面開展研究，并取得了較好的實驗結(jié)果。
　　(1)N基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建。本研究依據(jù)PEDV CV777株N基因的全序列設(shè)計引物，在

4、擴增出目的基因之后與真核載體pPM-C-His連接，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pPM-C-His-N，并利用菌液PCR、雙酶切鑒定以及測序分析對構(gòu)建的真核質(zhì)粒進行了驗證，結(jié)果均符合預(yù)期，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，為后續(xù)利用該重組質(zhì)粒進行實驗研究提供物質(zhì)材料。
　　(2)重組質(zhì)粒在Vero細胞中表達情況的鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞，并設(shè)置空載體對照組和陰性對照組，24h后提取細胞總RNA，并于轉(zhuǎn)染后24h、48h、60h分別提取細胞總蛋

5、白，檢測重組質(zhì)粒在基因水平和蛋白水平的表達情況;在轉(zhuǎn)染48h之后利用間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay,IFA）檢測N蛋白在細胞中的分布。瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的細胞在目的片段大小處均出現(xiàn)了條帶，并且在整個細胞中出現(xiàn)了特異性綠色熒光，而對照組未出現(xiàn)，說明該重組質(zhì)粒在基因水平與蛋白水平成功表達，且能夠在Vero細胞中瞬時表達。
　　(3)重組質(zhì)粒對小鼠

6、免疫水平的影響研究。將真核質(zhì)粒免疫昆明系小鼠，同時設(shè)置空載體對照組和陰性對照組;三免過后采集免疫血清，對三次采集的血清進行效價測定，并利用Western blotting對重組質(zhì)粒的反應(yīng)原性進行檢測;在無菌環(huán)境中制備小鼠脾淋巴細胞懸液，進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，測其OD570nm值，用SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，分析真核質(zhì)粒對小鼠細胞免疫水平的影響。ELISA結(jié)果顯示小鼠三免抗體效價達到1∶51，200，Western blotti

7、ng結(jié)果顯示在目的條帶大小處出現(xiàn)免疫印跡，而淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗顯示重組質(zhì)粒組淋巴細胞增殖率顯著高于空白對照組和陰性對照組，而空白對照和陰性對照組差異不顯著，表明了重組真核質(zhì)粒pPM-C-His-N具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，且可以顯著提高小鼠細胞免疫水平，為疾病的診斷以及疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。
　　(4)N蛋白對Vero細胞的影響研究。為了研究N蛋白亞細胞定位特征以及對Vero細胞的影響，根據(jù)其它冠狀病毒N蛋白亞細胞定

8、位研究的報道，首先利用生物信息學(xué)軟件對PEDV N蛋白NLS序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了一個潛在的核定位基序pat7，位于堿性氨基酸富集區(qū)，且表現(xiàn)出了與其他冠狀病毒同樣高的親水性，說明此基序是一個潛在的亞細胞定位信號，為PEDVN蛋白定位特征的研究提供可能。然后利用DAPI對細胞核進行染色，制片之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并分析N蛋白的定位特征;同時待轉(zhuǎn)染48h之后固定用PI染色，進行流式細胞分析其對Vero細胞周期的影響;結(jié)果顯示N蛋白主要定