XIAP熒光蛋白重組質粒的構建及其對HeLa細胞的作用.pdf

1、背景和目的:細胞凋亡的失衡與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，其失衡在不同的腫瘤細胞中有不同的表現(xiàn)。在目前已知的三條凋亡信號傳導通路中，凋亡抑制蛋白有著重要作用。因此，凋亡抑制蛋白在惡性腫瘤細胞中的作用是當前的研究熱點。XIAP是凋亡抑制蛋白家族中的一員，它可以通過抑制caspase-3,6,7,9的激活，從而阻斷細胞凋亡。目前有關XIAP在宮頸癌細胞系(HeLa)中的作用的報道罕見。本實驗旨在研究： (1)XIAP在HeLa細胞中的表達及作用，

2、(2)HeLa細胞中由腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的調亡與XIAP的作用關系。以期達到為宮頸癌的治療提供新靶點。 材料與方法:研究對象為人宮頸癌細胞系(HeLa)。采用：(1)免疫組織化學染色(S-P法)，觀察XIAP在：HeLa細胞中的蛋白表達及細胞內定位。(2)通過培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MCF-7，獲取總RNA，采用RT-PCR技術和基因克隆技術構建pEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合基因。(3)通過培養(yǎng)HeL

3、a細胞、細胞轉染，熒光顯微鏡觀察XIAP在細胞內的表達。(4)細胞轉染、TNF-α干擾(對照組、空白對照組、實驗組)、流式細胞術(FCM)等方法，檢測HeLa細胞的凋亡情況。 結果:(1)在HeLa細胞中存在XIAP蛋白表達，且陽性表達定位于細胞漿。(2)培養(yǎng)細胞MCF-7，采用RT-PCR技術，獲得了人類XIAP的全長cDNA(1494bp)。(3)采用基因克隆技術構建了pEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合基因，

4、通過PCR技術、酶切反應，證實其插入的片段與預知的相符。其融合蛋白在HeLa細胞中的定位主要表現(xiàn)為彌漫性地分布在細胞核和細胞漿。觀察3天，未發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)有明顯變化。(4)在轉染了重組質粒pDsRed2-XIAP的HeLa細胞中，加入TNF-α(50ng/ml)，于24t1后收集細胞，AnnexinV-FITC染色和FCM檢測，結果顯示部分HeLa細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率分別為：①未處理的HeLa細胞為3.92％，②對照組(只加腫瘤壞死因子

5、TNF-α)45.28％，③空白對照組(腫瘤壞死因子TNF-α+轉染空質粒pDsRed2-N1)45.20％，④實驗組(腫瘤壞死因子TNF-α+轉染質粒pDsRed2-XIAP)11.01％，轉染重組質粒組較同等外加條件下細胞凋亡低(P<0.01)。 結論:(1)HeLa細胞中有XIAP蛋白表達，且其陽性表達定位于細胞漿。(2)成功地構建TpEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合表達質粒。其融合蛋白在HeLa細胞中的定