重組質(zhì)粒pIRES-CD構(gòu)建及其對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞殺傷作用的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腺樣囊性癌,又稱圓柱瘤(cylindroma)，由Billroth首次報(bào)道，多數(shù)人認(rèn)為腫瘤來(lái)自涎腺導(dǎo)管，也可能來(lái)自口腔粘膜的基底細(xì)胞。腺樣囊性癌占涎腺腫瘤的5﹪～10﹪，在涎腺惡性腫瘤中占24﹪，其中在頜下腺及舌下腺中是居首位的惡性腫瘤，最多見(jiàn)的年齡是40～60歲。其主要的病理學(xué)特點(diǎn)為嗜神經(jīng)侵犯及易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前對(duì)腺樣囊性癌多主張采用手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療為主，其五年生存率一般在60﹪左右，其10年、15年、20年生存率分別為

2、30～39﹪、24～26﹪、12.5～21﹪，其療效仍然不能令人滿意。因此，探討新的治療方法具有極其重要的意義。 近年來(lái)腫瘤的基因治療發(fā)展迅速，主要的方法有自殺基因、免疫基因、多藥耐藥基因以及抗血管生成基因等。其中自殺基因被認(rèn)為是最有前景的基因治療方法之一。自殺基因治療,又稱酶/藥物前體療法(EPT)，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將哺乳動(dòng)物中所不含有的自殺基因轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞中，該基因表達(dá)的產(chǎn)物可將無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為毒性藥物，從而

3、選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞，常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV—TK)基因和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)基因，前者催化無(wú)毒性抗病毒核苷類似物如丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(ACV)等成為單磷酸核苷衍生物(dTMP)，然后在內(nèi)源性細(xì)胞激酶作用下轉(zhuǎn)化為有明顯毒性的三磷酸核苷(dTTP)，作為DNA合成鏈的終止劑，干擾細(xì)胞DNA的合成；后者編碼的胞嘧啶脫氨酶可催化5-氟胞嘧啶(5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-FU)，然后代謝為有

4、毒性的5-氟尿嘧啶-5'三磷酸(5-FUTP)和5-氟-2'脫氧尿嘧啶-5'三磷酸(5-FdUTP)，5-FUTP通過(guò)與UTP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制mRNA和tRNA的合成，5-FdUTP則作用于胸苷合成酶 (TS)，導(dǎo)致TMP的衰竭而阻止DNA的合成，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在以往的研究中單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷系統(tǒng)(HSV—tk/GCV)是一種很常見(jiàn)的自殺基因治療系統(tǒng)，由于前藥GCV不容易通過(guò)血腦屏障而在CNS應(yīng)用受到一定的

5、限制。而CD基因是另外一種自殺基因，哺乳動(dòng)物細(xì)胞不含該酶，細(xì)菌和真菌能產(chǎn)生該酶，可將5—FC脫氨為5—FU。臨床上5—FC和5—FU的藥代動(dòng)力學(xué)非常清楚，與5-FU不同，5-FC治療劑量對(duì)人體毒副作用不大，口服容易通過(guò)血腦屏障，這是CD/5-FC系統(tǒng)在治療口腔頜面部腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中，比HSV—tk/GCV系統(tǒng)應(yīng)用廣泛的原因。本實(shí)驗(yàn)正是基于此，旨在構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD，并將其轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞后，應(yīng)用前體藥物5-FC治療，初步探

6、討CD/5-FC系統(tǒng)對(duì)ACC-2細(xì)胞的殺傷作用及旁觀者效應(yīng)，以尋求有效的自殺基因治療方法。 方法:首先根據(jù)CD的DNA序列設(shè)計(jì)、合成引物，并將擴(kuò)增后產(chǎn)物插入克隆載體pMD18-T中，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-CD，進(jìn)行PCR篩選及重組質(zhì)粒的酶切分析，然后將重組質(zhì)粒pMD18-T-CD插入經(jīng)相應(yīng)酶切的真核表達(dá)載體pIRES，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CD，進(jìn)行菌落PCR初步鑒定及重組質(zhì)粒的酶切分析。然后以電穿孔方法將重組表達(dá)質(zhì)

7、粒pIRES-CD轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，新霉素(Gerleticin G418)篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)的ACC-2/CD細(xì)胞，并經(jīng)RT-PCR鑒定CD基因是否整合到ACC-2細(xì)胞DNA鏈中并轉(zhuǎn)錄表達(dá)。加入不向濃度的5-FC對(duì)ACC-2/CD細(xì)胞和ACC-2細(xì)胞進(jìn)行處理，并以未加藥組作對(duì)照，MTT法檢測(cè)藥物的殺傷效果及其對(duì)ACC-2細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(GIR)及半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)；并觀察ACC-2/CD與AC

8、C-2細(xì)胞在不同混育比例下應(yīng)用不同濃度5-FC對(duì)腺樣囊性癌的殺傷作用及旁觀者效應(yīng)。 結(jié)論: 1．成功克隆了大腸桿菌CD基因，并構(gòu)建了克隆載體．pMD18-T-CD，且對(duì)CD基因進(jìn)行序列分析顯示，克隆的序列和文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。 2．在克隆載體DMD18-T-CD的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRS-CD，并進(jìn)行了菌落分析和酶切鑒定。 3．應(yīng)用電穿孔的方法成功將pIRES-CD轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，并進(jìn)