真核表達質粒PIRES-Ag85B的構建及其在CHO細胞中的表達.pdf

1、目的：構建真核表達質粒PIRES-Ag85B，通過酶切鑒定和測序鑒定后在CHO細胞中進行表達，并用Western-blot檢測表達結果，為開發(fā)新型的結核病疫苗和結核病血清免疫診斷試劑奠定基礎。
　　 方法：根據(jù)GenBank上結核分枝桿菌Ag85B基因的CDS序列，應用primer premier5.0設計一對引物，分別在引物5’端引入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點及保護堿基。從結核分枝桿菌標準株H37Rv中提取基因組DNA，應用

2、引物，擴增Ag85B基因片段，用PCR回收試劑盒割膠回收后純化PCR產(chǎn)物，雙酶切PCR產(chǎn)物及真核表達質粒PIRES，經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉化DH5α感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素篩選陽性克隆后，再經(jīng)PCR，雙酶切和測序進行鑒定。應用脂質體轉染技術，將重組質粒PIRES-Ag85B轉染CHO細胞，48小時后用G418進行篩選.并用Western blot檢測Ag85B的基因表達。
　　 結果：從結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組DN

3、A中擴增出978bp的Ag85B基因，并成功構建真核表達質粒PIRES-Ag85B，經(jīng)NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切后電泳獲得61,000bp和978bp的條帶，與預期結果一致，經(jīng)測序證實獲得目的基因序列與GenBank公布的一致，轉染CHO細胞后獲得穩(wěn)定表達Ag85B的CHO細胞株，用Western blot方法在蛋白水平檢測Ag85B的基因表達。
　　 結論：1從結核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出Ag85B基因片段并成功構建真