攜帶HGFK1基因溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用.pdf

1、研究背景:胃癌在亞洲地區(qū)的發(fā)生率和死亡率都很高。傳統(tǒng)胃癌患者的治療方法有手術(shù)切除、化療以及放療等等，然而進(jìn)展期的胃癌患者接受傳統(tǒng)治療之后的五年生存率仍就不高。近年來，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，胃癌的各種生物治療臨床試驗(yàn)也廣泛研究。溶瘤病毒療法是利用天然或改造的病毒靶向性溶解腫瘤細(xì)胞來治療腫瘤，而抗血管生成治療則通過抗腫瘤血管生成來抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，我們?cè)O(shè)想將具有抗腫瘤細(xì)胞和抗血管生成作用的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子第一結(jié)構(gòu)域(HGFK1)基

2、因與溶瘤腺病毒相結(jié)合，研究其抗胃癌作用。
　　方法:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子(hTERT)和缺氧調(diào)控元件序列(HRE)分別調(diào)控溶瘤病毒的E1a和E1b基因，基因組插入HGFK1基因，構(gòu)建雙調(diào)控溶瘤腺病毒(TH-Ad-HGFK1-EGFP)，空斑計(jì)數(shù)法滴定病毒濃度;病毒分為三組:實(shí)驗(yàn)A組(TH-Ad-HGFK1-EGFP)、實(shí)驗(yàn)B組(TH-Ad-EGFP)和對(duì)照C組(Ad-EGFP)，分別感染胃癌細(xì)胞SGC7901和正常人成纖維細(xì)胞H

3、F;熒光顯微鏡下觀察病毒復(fù)制增殖情況，半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量法(TCID50)檢測(cè)病毒在細(xì)胞中的擴(kuò)增倍數(shù);噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)病毒對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷抑制作用;雙重?zé)晒馊旧珯z測(cè)病毒對(duì)胃癌細(xì)胞的促凋亡作用。
　　結(jié)果:溶瘤腺病毒TH-Ad-HGFK1-EGFP、TH-Ad-EGFP經(jīng)測(cè)序及PCR鑒定確認(rèn)構(gòu)建成功，滴度都為2×1010pfu/ml;病毒擴(kuò)增結(jié)果顯示:A、B組病毒在SGC7901細(xì)胞中的擴(kuò)增倍數(shù)分別為1.47×104倍、1.

4、6×104倍，遠(yuǎn)大于對(duì)照C組病毒，在HF細(xì)胞中為110倍和124倍，遠(yuǎn)小于對(duì)照C組病毒;MTT結(jié)果顯示:當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)=100時(shí)，A組病毒對(duì)SGC7901細(xì)胞72h、96h后的抑制率為(71.34±8.27)％、(74.56±1.78)％，B組為(30.58±3.83)％、(31.84±6.62)％，C組為(23.40±2.29)％、(21.18±2.32)％。A組與B組兩時(shí)間點(diǎn)分別比較有顯著差異(P=0.002、P=0.003)

5、，A組與C組分別比較也有顯著差異(P=0.003、P＜0.001)。A、B組病毒對(duì)HF細(xì)胞在96h后的抑制率為(18.94±0.88)％、(22.84±3.34)％，C組為(53.25±3.50)％，A、B兩組與C組分別比較有較大差異(P=0.003、P=0.001);凋亡結(jié)果顯示: A組SGC7901細(xì)胞的凋亡率為(18.66±4.04)％，遠(yuǎn)大于其余各組。
　　結(jié)論:溶瘤腺病毒TH-Ad-HGFK1-EGFP能在胃癌細(xì)胞SGC