TNF-α重組溶瘤腺病毒靶向殺傷胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究TNF-α重組溶瘤腺病毒（PPE3-F35-TNF-α）在體外對(duì)胃惡性腫瘤細(xì)胞存活影響、被感染細(xì)胞的死亡方式，并通過(guò)對(duì)其感染細(xì)胞后病毒自身的表達(dá)方式來(lái)對(duì)人類的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的研究。
　　方法：
　　首先對(duì)TNF-α重組溶瘤腺病毒進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，然后將其分離；對(duì)其繁殖能力和滴度進(jìn)行測(cè)試，最后透過(guò)顯微鏡觀察分離后的細(xì)胞的表達(dá)方式。運(yùn)用MTT對(duì)重組后的病毒進(jìn)行殺傷情況的檢驗(yàn)，并對(duì)其進(jìn)行凋亡檢測(cè)，最

2、后形成一定的表達(dá)量，通過(guò)對(duì)表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br>　　結(jié)果：
　　1、腺病毒體外繁殖能力的測(cè)定：通過(guò)對(duì)溶瘤腺病毒進(jìn)行感染后，靜置48小時(shí)，隨后用顯微鏡觀察其表達(dá)形式的變化，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞本身的形態(tài)沒(méi)有發(fā)生變化，但是分別感染了兩種病菌的細(xì)胞都有了EGFP表達(dá)。將細(xì)胞進(jìn)行感染后第八天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行取樣再次對(duì)其進(jìn)行感染，發(fā)現(xiàn)感染病毒的細(xì)胞仍有EGFP表達(dá)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，我們能夠發(fā)現(xiàn)，SGC-7901l細(xì)胞感染

3、的程度受到裂液的不同感染程度也不同，其中受到PPE3-F35-TNF-α的裂解液感染后的病毒滴度要高一些。
　　2、溶瘤病毒對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們?nèi)〉昧耸艿讲煌《靖腥镜哪[瘤細(xì)胞，他們之間的滴度不同。除此之外，也選取沒(méi)有受到感染的細(xì)胞，同時(shí)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞活力的測(cè)定。我們運(yùn)用MTT法進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)PPE3-F35-TNF-α對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用。當(dāng)病毒的濃度較高時(shí)，其殺傷的作用也較大。通過(guò)對(duì)感染天數(shù)不同的細(xì)胞

4、進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其殺傷的危害隨著時(shí)間的長(zhǎng)短變化不同而不同，一般是對(duì)感染時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞的殺傷作用會(huì)更大一些。
　　3、凋亡檢測(cè)：分別用MOI值為10的PPE3-F35-TNF-α及AD/CMV-EGFP感染SGC-7901細(xì)胞48小時(shí)后用Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)定量分析進(jìn)行凋亡檢測(cè)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們能夠看到受到感染的細(xì)胞的凋亡處理更明顯，細(xì)胞計(jì)數(shù)后的結(jié)果顯示：PBS組、AD/CMV-EGFP組、PPE3-F35-TNF-α組的凋

5、亡率為分別為1.44±0.15％、1.75±0.47％、10.75±1.24％(P<0.01)。
　　4、雙抗體夾心法（ELISA）檢測(cè)TNF-α的表達(dá)量：PPE3-F35-TNF-α感染SGC-7901細(xì)胞株后大量表達(dá)TNF-α為1463.44±53.47pg/ml；AD/CMV-EGFP組感染后TNF-α的表達(dá)量分別為16.06±1.52pg/ml(P<0.05)，對(duì)正常細(xì)胞均無(wú)明顯表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、PP