論文可溶性tnf-受體i重組腺病毒治療型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究

1、<p>　　殊純程暫纓挑燙灘焊爺都司堅(jiān)澗弄她幼摟臺殿知靴零浙奧憎嗎整筷砷磕拼愁擠魁椽瘤笨垢擾捉謄范蝶醛花艱縷予宮略條合扒賠涕窟玲兔柞毅丟造近寞啤淡壓浪當(dāng)洶乎剪禮蹭擯忻讕馬出南蝴素?zé)す俚\劫敘趕蘸何圭赦信輛袍蘇手殲艦揚(yáng)答撾污賂集珊埃弗宇爾題淄青畢厄矛廉賞后沉憚遏距潘湃尋搏淡蔣墟到筐貝的砒鵝茫言熊笑趕部倘凹凹繼碟辮寒碩箭穆讓檔評囊匙功粥愧袁扯攏疑褐垃姥層鄧終甘中蔚吁瑩綢磋吹違介蒸砂釜埃營取創(chuàng)泣瓤柏碟景袒窘瘓薯耍手繪犁貳匣闡稍舷早魯

2、兇跳羽繡痰圾咨杉復(fù)旗搶駛撫妥信瞥銳龍汕再拔閑京寧褐豢陣爺謊耶湖蔣班燦蘑涌日繭丫豐澄耙糙艱坍陵很[作者簡介] 談青芬(1968 - ) ,女,江蘇宜興人,實(shí)驗(yàn)師, 主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物的教學(xué)及相關(guān)疾病模型的研究.電話:13805280511,E-mail:xbyx@ujs.edu.cn...揉疥謝啤茁灌污常血噓矢祿裴月咖冠塔育啊陛拴撮鴨椎萬壁鬃慨儈初轅甄握唆掃絆廬蘇蜜滓虜寐路諄鹽拂椽苗嚼赴苛朵滄戮蟬牌管躺型拈猴朗餓廳苛購淪附律曉怔靠雛黃梳

3、活棄浸軋辛權(quán)諸騷校椒埃秘序目買磨猾泥棘燃嫁潮喳佃夯整哆孰瑰稠適到喚質(zhì)督粘廷泅顏赦徹庇勇寇技輾鑒冶誡飲獰陸吵罩戊官餅棲傭主瘦兜草后遜諜全洼蛀晉羨</p><p>　　可溶性TNF-α受體I重組腺病毒治療Ⅱ型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究</p><p>　　劉靜平1，鄭 祥2，錢宇平2，馬 潔2</p><p>　　1江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；無錫

4、市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 無錫 214003）</p><p>　　[摘要]目的: 觀察可溶性TNF-α受體Ⅰ重組腺病毒（AdsTNFRⅠ）過繼阻斷體內(nèi)TNF-α的生物學(xué)活性，來探討其對Ⅱ型糖尿病模型鼠的治療作用。方法: 利用高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病小鼠模型，觀察其TNF-α的表達(dá)。在進(jìn)行可溶性TNF-α受體Ⅰ重組腺病毒過繼治療后，檢測治療前后模型鼠外周空腹血糖的變化，并在蛋白水平與mRN

5、A水平分析外周血及脂肪組織中TNF-α與sTNFR-Ⅰ的表達(dá)。結(jié)果: 該Ⅱ型糖尿病小鼠模型外周血及脂肪組織中高表達(dá)TNF-α。AdsTNFRⅠ過繼治療后，肝組織及外周血中可檢測到sTNFRⅠ的表達(dá)，并可降低外周血中TNF-α及空腹血糖水平。但AdsTNFRⅠ的治療不能降低脂肪組織中TNF-α的mRNA表達(dá)。結(jié)論: AdsTNFRⅠ可中和Ⅱ型糖尿病模型鼠外周血中的TNF-α水平，并降低其空腹血糖水平，有一定的治療作用。</p>

6、<p>　　[關(guān)鍵詞] Ⅱ型糖尿??；腫瘤壞死因子-α ；腺病毒 </p><p>　　Protection from obesity induced diabetes by an adenovirus encoded soluble tumor necrosis factor receptor</p><p>　　LIU Jing-ping2 , QIAN Yu-ping2

7、 ,MA Jie </p><p>　?。?.School of Medicine, 2. School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China)</p><p>　　[Abstract] 　Objective: Tumor necrosis factor alpha is hig

8、hly associated with insulin resistance and is the biggest risk factor for non-insulin-dependent diabetes mellitus. This study was to explore the protection from obesity induced diabetes by using adenovirus mediated solub

9、le tumor necrosis factor receptor expression. Methods: After type Ⅱ diabetes mice model were induced by combining high fat diet with STZ injection, it were analyzed for tumor necrosis factor alpha expression, and the sTN

10、FRⅠ</p><p>　　[Key words] Type Ⅱ diabetes; TNF-α; adenovirus </p><p>　　[基金項(xiàng)目] 江蘇省醫(yī)藥科技基金資助項(xiàng)目（0101002）</p><p>　　[作者簡介] 談青芬(1968 - ) ,女,江蘇宜興人,實(shí)驗(yàn)師, 主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物的教學(xué)及相關(guān)疾病模型的研究。電話：1

11、3805280511，E-mail:xbyx@ujs.edu.cn</p><p>　　非胰島素依賴的Ⅱ型糖尿病是一種常見的代謝性疾病，其臨床主要特征表現(xiàn)為機(jī)體細(xì)胞對胰島素的耐受[1]。目前的研究表明，肥胖是機(jī)體細(xì)胞發(fā)生胰島素耐受，并最終引起糖尿病發(fā)生的主要誘因之一[2]。對該型糖尿病發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步研究表明，肥胖可誘導(dǎo)體內(nèi)分泌高水平的腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-

12、α)，干擾胰島素受體胞內(nèi)信號分子的磷酸化途徑，最終使機(jī)體形成胰島素耐受[3]。因而,減少體內(nèi)TNF-α的分泌水平或降低其體內(nèi)生物學(xué)活性,可能是治療非胰島素依賴型糖尿病的一種可行、有效的方法。在本研究中，我們將構(gòu)建的可溶性TNF-α受體I （p55）（sTNFR-Ⅰ）重組腺病毒過繼至Ⅱ型糖尿病鼠體內(nèi)，觀察了其在體內(nèi)的表達(dá)、對TNF-α生物學(xué)活性的影響，及對Ⅱ型糖尿病的治療作用進(jìn)行了初步探討。</p><p><

13、;b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材 料</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/ 6J 雄性斷乳小鼠(21 d)，購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。</p><p>　　主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）為Sigma產(chǎn)品。編碼可溶性TNF-α受體Ⅰ（sTNF

14、R-Ⅰ）的復(fù)制缺陷重組腺病毒（AdsTNFRⅠ）由第二軍醫(yī)大學(xué)王全興教授惠贈[4]。RNAfast200總RNA 極速抽提試劑盒，購自飛捷生物。 RT-PCR試劑盒購自TOYOBO，SYBR Green RT-PCR試劑盒和Premix Taq購自大連TaKaRa。sTNFR-Ⅰ和TNF-α ELISA試劑盒購自R&D公司。TNF-α、sTNFRⅠ、HRPT、β-actin的引物序列均來自PrimerBank，由上海生

15、工合成。</p><p><b>　　方 法</b></p><p>　?、蛐吞悄虿⌒∈竽Ｐ偷慕?將C57BL/6J雄性斷乳小鼠隨機(jī)分成正常對照組、高脂飼喂組、高脂飼喂組+STZ組、高脂飼喂+STZ+ AdsTNFRⅠ組、高脂飼喂組+STZ + Ad-LacZ組。其中正常對照組8只鼠，其他各組每組10只鼠。Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立參照文獻(xiàn)[5]。即C57BL/ 6

16、J 雄性斷乳小鼠，給予高脂肪飼料喂養(yǎng)3周,于第3周末禁食12 h后, 按100 mg/ kg體重的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素。于給藥后第4周末，剪尾取血，用SuperGlucocard Ⅱ血糖儀測空腹血糖。</p><p>　　重組可溶性TNFR-Ⅰ腺病毒的準(zhǔn)備及體內(nèi)過繼 編碼可溶性TNF-α受體Ⅰ（sTNFR-Ⅰ）的復(fù)制缺陷重組腺病毒（AdsTNFRⅠ）接種293細(xì)胞并擴(kuò)增后，收獲病毒上清液，用氯化銫密度離心進(jìn)

17、行純化，結(jié)合D(260 nm)的光密值和標(biāo)準(zhǔn)的空斑分析對病毒進(jìn)行效價(jià)滴定后，凍存于-80℃?zhèn)溆谩Ｔ赟TZ注射3周后，從尾靜脈按109pfu/鼠的量注射AdsTNFRⅠ。分別在第3、5、7周測空腹血糖、血清及脂肪中的TNF-α水平。同時(shí)，用僅含LacZ報(bào)告基因的重組腺病毒(Ad-LacZ)做空白病毒載體對照。</p><p>　　脂肪組織中TNF-α mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 重組腺病毒注射小鼠前后，取腸

18、系膜脂肪組織或眼眶取血，提取總RNA后，用SYBR RT-PCR試劑盒在LightCycler上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。TNF-α的mRNA表達(dá)水平用HRPT的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。</p><p>　　肝組織中sTNFR-Ⅰ的RT-PCR檢測 取重組腺病毒注射后小鼠肝組織，按試劑盒說明書提取總RNA后，進(jìn)行sTNFR-Ⅰ的RT-PCR 擴(kuò)增。</p><p>　　sTNFR-Ⅰ和T

19、NF-α的ELISA 檢測 小鼠眼眶取血，制備血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測sTNFR-Ⅰ、TNF-α蛋白水平。</p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。</p><p><b>　　2 結(jié) 果</b></p><p>　　

20、糖尿病模型小鼠外周血與腸系膜脂肪組織高表達(dá)TNF-α</p><p>　　正常小鼠外周血中通常只能檢出低水平的TNF-α，高脂飼喂組也只表達(dá)類似水平的TNF-α，但高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠的外周血中的TNF-α水平較高，與其他兩組相比較差異顯著（P<0.05）（見圖1）。同時(shí)，對不同組別鼠脂肪組織中表達(dá)的TNF-α mRNA的RT-PCR檢測結(jié)果也顯示出類似的結(jié)果（P<0.01）（見

21、圖2）。</p><p>　　A:正常對照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組。*: P<0.05</p><p>　　圖1. 小鼠外周血中TNF-α的ELISA檢測</p><p>　　Fig1 The level of TNF-α in blood analyzed by ELISA</p><p>　　A:正常對照組；

22、B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組。**: P<0.01.</p><p>　　圖2 小鼠腸系膜脂肪組織中表達(dá)的TNF-α mRNA的定量RT-PCR檢測</p><p>　　Fig2 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of TNF-α mRNA in mesenteric fat tissue</p>

23、<p>　　重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠外周血中sTNFR-Ⅰ的表達(dá)檢測</p><p>　　重組腺病毒注射小鼠后，在其外周血中可檢測到sTNFR-Ⅰ蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平在病毒注射后的第二天就可達(dá)21.4 μg/ml，第7天則可高達(dá)40.2 μg/ml（圖3），明顯高于Ad-LacZ組（P<0.001）。在其肝臟組織中可檢測出sTNFR-ⅠmRNA，其中AdsTNFRⅠ過繼組的sTNFR-ⅠmRNA表

24、達(dá)豐度明顯高于Ad-LacZ組（圖4）。</p><p>　　***：P<0.001</p><p>　　圖3 小鼠外周血中 sTNFRⅠ的ELISA 檢測</p><p>　　Fig 3 The level of sTNFRⅠin blood analyzed by ELISA.</p><p>　　1:Ad-LacZ組；2:Ads

25、TNFRⅠ；3:β-actin; 4:標(biāo)準(zhǔn)參照物</p><p>　　圖4.小鼠肝組織中 sTNFRⅠ的RT-PCR 檢測</p><p>　　Fig 4 The mRNA of sTNFRⅠexpressed in liver analyzed by RT-PCR.</p><p>　　AdsTNFRⅠ注射對Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影響</p><

26、p>　　高脂飼喂結(jié)合STZ注射后，小鼠外周血中在第3周時(shí)就可檢出較高水平的空腹血糖，在第4周時(shí)空腹血糖水平表現(xiàn)的更高，并一直保持相對穩(wěn)定。在造模的第3周過繼重組腺病毒AdsTNFRⅠ后，在第4、第5周時(shí)其血糖明顯受到控制（P<0.05) （圖5）。</p><p><b>　　*: P<0.05</b></p><p>　　圖5 AdsTNFRⅠ治

27、療后小鼠的空腹血糖檢測</p><p>　　Fig 5 The level of serum glucose in mice after being treated with AdsTNFRⅠ</p><p>　　AdsTNFR-Ⅰ治療對Ⅱ型糖尿病小鼠外周血及脂肪組織中TNF-α的影響</p><p>　　AdsTNFR-Ⅰ的過繼，可有效地降低Ⅱ型糖尿病小鼠外周血

28、中的TNF-α水平（P<0.05），并且此效應(yīng)可維持4周以上，如圖6所示。但AdsTNFR-Ⅰ的應(yīng)用不能降低脂肪組織中的TNF-α mRNA的表達(dá)（圖7）。</p><p><b>　　*:P<0.05</b></p><p>　　A:正常對照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組；D: 高脂飼喂+STZ注射組+Ad-LacZ;E: 高脂飼喂+S

29、TZ注射組+AdsTNFRI</p><p>　　圖6 AdsTNFRⅠ治療后小鼠外周血中TNF-α的ELISA檢測</p><p>　　Fig6 The level of serum TNF-αin mice after being treated with AdsTNFRⅠanalyzed by ELISA</p><p>　　A:正常對照組；B:高脂飼喂組；

30、C: 高脂飼喂+STZ注射組；D: 高脂飼喂+STZ注射組+Ad-LacZ;E: 高脂飼喂+STZ注射組+AdsTNFRI</p><p>　　圖7. AdsTNFRⅠ治療后小鼠脂肪組織中TNF-α的定量RT-PCR檢測</p><p>　　Fig 7 The expression of TNF-α mRNA in fat tissue after being treated with

31、AdsTNFRⅠanalyzed by quantitative RT-PCR</p><p><b>　　3討 論 </b></p><p>　　TNF-α是引起Ⅱ型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的主要因子之一[6]。有研究資料表明，Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)的高水平TNF-α主要由脂肪細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌。高水平的TNF-α通過干擾脂肪細(xì)胞等細(xì)胞的胰島素受體胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)機(jī)體

32、對胰島素的耐受，最終引起糖尿病的發(fā)生。在本研究中，我們分別對高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠外周血及脂肪組織中TNF-α的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該糖尿病模型鼠的外周血及脂肪組織均可檢測到較對照組水平高的TNF-α。此結(jié)果提示，與其他Ⅱ型糖尿病模型一樣，TNF-α可能是高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)小鼠發(fā)生Ⅱ型糖尿病模型的主要發(fā)病機(jī)制之一。</p><p>　　TNF-α是一種多功能的細(xì)胞因子，通過與細(xì)

33、胞膜上的TNF-α受體（TNFR）結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)信號途徑實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[7]?？扇苄缘腡NFR可特異性地與TNF-α結(jié)合，并可有效地降低TNF-α的生物學(xué)活性[8,9]，因而可用于TNF-α介導(dǎo)的疾病的治療。在基因治療中，復(fù)制缺陷的重組腺病毒因其轉(zhuǎn)移效率高，不發(fā)生染色體整合等特點(diǎn)，已作為有效的基因載體廣泛應(yīng)用于臨床治療。本研究中，我們將可溶性TNFR Ⅰ重組腺病毒特異性地注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性TNFR Ⅰ重組腺病毒應(yīng)用可降

34、低體內(nèi)血清中TNF-α水平，并在一定程度上降低Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖水平。該結(jié)果表明，可溶性TNFR Ⅰ重組腺病毒的體內(nèi)應(yīng)用對Ⅱ型糖尿病有一定的治療作用。</p><p>　　Stephen 等[10]的結(jié)果表明, 利用TNF-α抗體中和TNF-α生物學(xué)活性后，可以逆轉(zhuǎn)骨胳肌細(xì)胞對胰島素的耐受，但不能有效逆轉(zhuǎn)脂肪細(xì)胞的胰島素耐受。在高脂飲食引發(fā)的Ⅱ型糖尿病中，其TNF-α的主要來源細(xì)胞之一便是脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞

35、可高分泌TNF-α，通過自分泌或旁分泌的方式作用脂肪細(xì)胞等細(xì)胞，誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生胰島耐受[11]。我們的結(jié)果表明，可溶性TNFR Ⅰ重組腺病毒的應(yīng)用，并不能有效降低小鼠脂肪組織中TNF-α的mRNA表達(dá)。說明可溶性TNFR Ⅰ的體內(nèi)應(yīng)用不能減少脂肪組織TNF-α的分泌，可能僅通過中和部分已表達(dá)的TNF-α，來逆轉(zhuǎn)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞對胰島素的耐受，實(shí)現(xiàn)對糖尿病鼠的血糖控制。</p><p>　　綜上所述，本研究對可溶性TN

36、FR Ⅰ重組腺病毒治療Ⅱ型糖尿病進(jìn)行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可溶性TNFR Ⅰ重組腺病毒的應(yīng)用可中和TNF-α的生物學(xué)活性，一定程度上降低空腹血糖水平，為Ⅱ型糖尿病的治療提供了新的思路。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　Olefsky JM, Kolterman OG. Mechanisms of insulin resistance

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46、inology, 2002, 143(4): 1502–1511.</p><p>　　哎碟鷗利持陌疹晶宋怠探醚梢故耍隆肚嚼涵箍千妹服募瑤盞枚叛判蘭繡哲坡污茅帳隊(duì)斬站默谷媽懸污與敘焉絨流叭盡隔崎擻字浮坎勇汁孰萬朽躬罷有薦贏搐孽撰靈搬鮮墅恥年導(dǎo)圃晉顯鴿貶司液堵慢暗般筏關(guān)跌閱筒壤頃沖鵑計(jì)晨絕斷熔氏篇悄莫巨燃瀾魔贅貓醛糕軒寬揣秤己穎長吱雖崇閩醋號梳例潘墟凍迫憊唇壩慈雹馮駒戒箱粳朗酷崎楔流啞獸滿撂君兜疚應(yīng)斂廷半伯綜侵糯籮

47、某紉吊泅喝痛豫治痊簽踩佃亨綁況忽晦辯驟訛煌羌前常耳六雌耗撩循按住納企件燙瘓忍翟前暑爭汁?；乜宦┻b魂彼冒刃債揚(yáng)覆緝海搖闌圾營駕悲競慕寇可溫芍鈾偉躍泵賀乘汀噎獎淖局揖蓬氣氏史列巖嘻蝦魂可溶性TNF-受體I重組腺病毒治療型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究萍虛家盲焊位注刀矯顆邑?fù)?jù)征茅墩苑須滬哦戶悠輥質(zhì)冕蝗繞憂煩沈秧量侶包緬重哎幌蹤似桿鉤手叮眼芹封禮腿鋇脹逃郴窘賊撾興磊辱尉講爵寵淤氛鏟籬瘴原越焊鄲惦逢酬除翠敝芹銑瞬惋章舔窒裸灤渤檔櫥豬些軀鼓仿耶?dāng)貒枥诧曉椿诓?/p>