新型溶癌腺病毒SG235對(duì)血液腫瘤細(xì)胞殺傷作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類(lèi)最嚴(yán)重的疾病之一,治療惡性腫瘤的方法主要有外科(手術(shù)切除)、化療、放療,后來(lái)又出現(xiàn)了生物治療.病毒治療也屬于生物治療方法,近20年來(lái)發(fā)展非常迅速,臨床試驗(yàn)的結(jié)果也令人鼓舞,為腫瘤的治療開(kāi)辟了新的路徑. 我們構(gòu)建了一個(gè)新型溶瘤腺病毒SG235,此病毒以5型腺病毒為骨架,35型病毒的shaft、knob和5型的traii構(gòu)成病毒的fiber,E1855KD區(qū)缺失的嵌合型病毒,此病毒克服了以前需要依賴腫瘤細(xì)胞表面CA

2、R高表達(dá)的局限性,特異性的針對(duì)P53缺失或者突變的腫瘤細(xì)胞,而對(duì)有P53功能的正常細(xì)胞沒(méi)有影響.病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖,并且激活凋亡通路,引起腫瘤細(xì)胞死亡,釋放子代病毒繼續(xù)感染周?chē)牟《?而達(dá)到殺滅所有腫瘤細(xì)胞的目的. 方法： 1、利用攜帶有能表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒載體SG235-EGFP(enhance Greenfluorescent protein),體外感染血液腫瘤細(xì)胞MUTZ-1、Kasumi、K562、

3、HL-60、Molt-4、RPMl8226、L428、Jurkat,利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察感染效果. 2、利用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)GFP在SG235-EGFP感染后的不同血液腫瘤細(xì)胞中的的表達(dá)量. 3、應(yīng)用MTT法,檢測(cè)SG235對(duì)血液腫瘤細(xì)胞株增殖的影響. 4、利用Annexin V/PI雙染及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡. 5、SG235感染MUTZ-1,電鏡下觀察凋亡細(xì)胞. 6、Wester

4、n Blot檢測(cè)SG235感染血液腫瘤細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、p-AKT蛋白的表達(dá). 7、SG235分別瘤內(nèi)注射MUTZ-1、Kasumi荷瘤小鼠,觀察SG235病毒體內(nèi)的抗瘤能力.8、SG235感染造血干細(xì)胞,觀察病毒對(duì)正常造血組織的影響. 結(jié)果：不同感染復(fù)數(shù)MOI(Multiplicity of Infection,MOI)SG235-EGFP體外感染血液腫瘤細(xì)

5、胞MUTZ-1、Kasumi、K562、HL60、Molt-4、RPMl8226、L428、Jurkat 48小時(shí)后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)GFP在不同血液腫瘤中均有表達(dá).熒光顯微鏡結(jié)果顯示,5、25、 50 MOI的SG235-EGFP感染MUTZ-1、Kasumi細(xì)胞株24、48小時(shí)后,能夠表現(xiàn)不同強(qiáng)度的熒光,隨著感染復(fù)數(shù)的增高和時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng).MTT法檢測(cè)了SG235對(duì)MUTZ-1、Kasumi細(xì)

6、胞生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)SG235顯著抑制MUTZ-1、Kasumi細(xì)胞的生長(zhǎng),抑制作用呈劑量及時(shí)間依賴方式.我們進(jìn)一步采用電鏡、TUNEL及流式細(xì)胞儀檢測(cè)了MUTZ-1和Kasumi細(xì)胞的凋亡,結(jié)果顯示SG235感染MUTZ-1 48小時(shí)后可以出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚,而流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示SG235感染MUTZ-1、Kasumi細(xì)胞48h后,隨著感染復(fù)數(shù)的增加,細(xì)胞凋亡率也增加. 為進(jìn)一步闡明SG235啟動(dòng)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的通路,我們

7、采用Western Blot法檢測(cè)caspase9及3蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)50 MOISG235作用MUTZ-1細(xì)胞24h、48h可出現(xiàn)caspase3和caspase9大小分別為19kDa及37kDa的活性條帶,進(jìn)一步檢測(cè)caspase 3的作用底物PARP蛋白,同樣可檢測(cè)到其大小為89kDa的活性片段,說(shuō)明caspase9、3及PARP的激活是SG235誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的重要途徑.我們用SG235感染染造血干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)病毒對(duì)造血

8、干細(xì)胞形成集落能力沒(méi)有改變.SG235瘤內(nèi)注射MUTZ-1、Kasumi荷瘤小鼠,顯示SG235病毒在體內(nèi)具有抗瘤能力,可以縮小瘤體體積,延長(zhǎng)荷瘤小鼠壽命. 結(jié)論： 1、溶癌腺病毒SG235能在體外成功感染血液腫瘤細(xì)胞MUTZ-1、Kasumi、K562、HL-60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat,并具有較高的感染效率. 2、溶癌腺病毒SG235對(duì)MUTZ-1、Kasumi細(xì)胞具有明顯的生

9、長(zhǎng)抑制作用,且具有時(shí)間一劑量依賴關(guān)系. 3、溶癌腺病毒SG235不影響正常造血干細(xì)胞集落形成. 4、溶癌腺病毒SG235通過(guò)激活caspase9、3及PARP誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡. 5.溶癌腺病毒SG235在SCID小鼠體內(nèi)具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間的作用. 6、SG235載體在血液腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制具有腫瘤特異性,這可能跟血液腫瘤細(xì)胞p53功能缺失相關(guān). 7、SG235具有的腫瘤