雙自殺基因重組腺病毒靶向治療大腸癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:在世界范圍內(nèi)，大腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第三位。它惡性程度高，進(jìn)展快，轉(zhuǎn)移早。如何有效治療大腸癌，抑制轉(zhuǎn)移，是目前腫瘤基因治療的一個(gè)難點(diǎn)。在眾多治療方法中，自殺基因治療是其中研究較多的領(lǐng)域。自殺基因，又稱為前藥敏感基因，是病毒和細(xì)菌等原核生物含有的一類基因，其編碼的酶能將原來無毒的或微毒的藥物前體轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的代謝物進(jìn)而殺傷宿主細(xì)胞。如TK基因通過編碼生成的胸苷激酶特異地將核苷類似藥物前體(GCV)磷酸化，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)代

2、謝成三磷酸丙氧鳥苷，后者抑制細(xì)胞DNA聚合酶的功能或競(jìng)爭性的滲入細(xì)胞DNA，使其合成終止，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；CD基因則通過編碼胞嘧啶脫氨酶將無毒的前體藥物5-FC代謝成抗DNA合成的化療藥5-FU從而殺傷細(xì)胞。該療法不但能直接殺傷轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞，還可利用其獨(dú)特的“旁觀者效應(yīng)”殺傷周圍大量未轉(zhuǎn)基因的瘤細(xì)胞，具有先轉(zhuǎn)染后治療、可靶向作用、可誘導(dǎo)免疫等優(yōu)點(diǎn)，使該治療方法在腫瘤的基因治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但同時(shí)，目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率低、反復(fù)治療后腫瘤細(xì)

3、胞具有抗藥性和類型不同的腫瘤細(xì)胞各自敏感的自殺基因治療系統(tǒng)不同等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了自殺基因治療的應(yīng)用效果。如何采取更有效的自殺基因系統(tǒng)是目前所急需解決的問題。 本課題擬構(gòu)建以KDR啟動(dòng)子調(diào)控下的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒，靶向治療大腸癌；一方面雙自殺基因選擇性殺傷高表達(dá)KDR的大腸癌細(xì)胞；另一方面，KDR啟動(dòng)子介導(dǎo)雙自殺基因選擇性殺傷分化迅速的腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞腫瘤血供，進(jìn)而殺傷大腸癌。兩者協(xié)同作用，雙途徑，多方位的治療大

4、腸癌。 目的:研究KDR啟動(dòng)子調(diào)控下的雙自殺基因重組腺病毒系統(tǒng)靶向殺傷大腸癌細(xì)胞，為腫瘤的基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先利用改進(jìn)的AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶KDR啟動(dòng)子/CMV啟動(dòng)子調(diào)控的雙自殺基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒。通過構(gòu)建AdEasier-1細(xì)菌后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組的“兩步轉(zhuǎn)化法”來簡化實(shí)驗(yàn)過程。構(gòu)建好的腺病毒用于感染表達(dá)KDR受體的大腸癌LOVO細(xì)胞和血管內(nèi)皮ECV304細(xì)胞，及不表達(dá)KDR受體的LS174T細(xì)胞，測(cè)定感

5、染效率，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞施以前藥，觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)前藥的敏感性，比較不同轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)前藥的敏感性差異；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)治療對(duì)細(xì)胞周期的影響。 結(jié)論: 一.應(yīng)用兩步轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建腺病毒重組體，經(jīng)PCR鑒定擴(kuò)增出目的片段。實(shí)驗(yàn)證明兩步轉(zhuǎn)化法的方法可行、周期短、費(fèi)用低； 二.KDR驅(qū)動(dòng)雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)大腸癌LOVO細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304具有強(qiáng)殺傷作用，其殺傷效率與前藥濃度和重組病毒MOI相關(guān)。