NV-lipocalin2抗大腸癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶Lipocalin2基因的條件增殖型溶瘤腺病毒NV-lipocalin2，并應(yīng)用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究NV-lipocalin2抗大腸癌的作用及其機(jī)制。
　　方法：利用RT-PCR技術(shù)獲取目的基因Lipocalin2并將其克隆至pCA13質(zhì)粒,構(gòu)建重組的質(zhì)粒pCA13-lipocalin2。使用BglⅡ酶從pCA13-lipocalin2質(zhì)粒中酶切出包含lipocalin2基因及CMV啟動(dòng)子的表達(dá)框,把該表達(dá)框再亞克

2、隆入質(zhì)粒pZD55,獲得重組質(zhì)粒pZD55-lipocalin2。之后分別將pCA13-lipocalin2和pZD55-lipocalin2與pBHGE3共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞,經(jīng)過(guò)同源重組產(chǎn)生攜帶lipocalin2基因的靶向性溶瘤腺病毒（NV-lipocalin2）。并用PCR方法和wester-blot方法對(duì)新構(gòu)建的病毒從基因和蛋白水平進(jìn)行鑒定。把獲得的NV-lipocalin2病毒按不同濃度加入到大腸癌細(xì)胞SW480中，采用四甲基

3、偶氮哩鹽叮（MTT）法檢測(cè)其對(duì)腫瘤的增殖抑制效應(yīng)，以及其分別與中藥姜黃素和化療藥物5-FU的協(xié)同抗腫瘤作用,采用Annexin V/PI染色流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,采用透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡，最后采用wester-blot法,檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3，9的蛋白表達(dá),以研究NV-lipocalin2誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　結(jié)果：通過(guò)PCR鑒定病毒DNA序列顯示：NV-lipocalin2保留了E1A區(qū)缺失了E1B55

4、序列。借助lipocalin2的CDS區(qū)設(shè)計(jì)的引物能從構(gòu)建的病毒中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的基因條帶；同時(shí)采用wester-blot法可檢測(cè)到被腺病毒感染的SW480細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)Lipocalin2蛋白。重組的靶向性增殖型腺病毒抗大腸癌SW480細(xì)胞的作用優(yōu)于單存的病毒載體（ZD55），其抗癌作用呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，其與中藥姜黃素和化療藥物5-FU都有很好的協(xié)同治療作用并呈濃度依賴性。NV-lipocalin2可通過(guò)活化Caspase-3,9