HKP-miR-150抗大腸癌微核酸藥物的前期研發(fā).pdf

1、目的：
　　以microRNA-150（miR-150）為活性藥物成分（API），以組氨酸-賴氨酸聚合物（Histidine-Lysine Polymer，HKP）作為體內導入載體，研究與開發(fā)微核酸-多肽注射藥物用于大腸癌的特異性靶向治療。
　　方法：
　?。?）配體靶向型載體與微核酸混合試劑的制備
　　采用1％的瓊脂糖作為凝膠電泳支持物，通過瓊脂糖凝膠電泳，定性觀察不同質量的HKP對micro RNA的包載能力

2、，初步確定HKP與micro RNA的質量比。通過動態(tài)光散射原理，利用激光粒度儀測量不同質量比例的HKP與micro RNA形成納米復合物的粒徑電位，將其作為HKP與micro RNA不同質量比的穩(wěn)定性參考。應用一種超靈敏的核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對HKP與micro RNA形成納米復合物的包封率進行測定。使用實時熒光定量 PCR法對導入混合制劑后的 LoVo細胞內靶基因mRNA的表達水平進行半定量分析，以檢測HKP-mi

3、R-150混合制劑的體外生物學活性。
　?。?）人大腸癌LoVo細胞系異體移植瘤模型建立及HKP-miR-150混合制劑藥效學驗證
　　4周齡BALB/c裸鼠在無特殊病原菌（Specific pathogens free，SPF）環(huán)境下經(jīng)1周的環(huán)境適應期后，取對數(shù)生長期的人大腸癌細胞系LoVo細胞用于皮下移植，每只裸鼠皮下接種5×106個細胞，約7天后成瘤并將裸鼠隨機分成6組。將經(jīng)HKP包載的miR-150及其它控制組的微核

4、酸藥物制劑注射入腫瘤組織，每兩天注射一次藥物，連續(xù)治療9次，整個過程共計18天。隨時觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤大小、形狀及生長狀況。處死裸鼠后分離皮下腫瘤組織，使用熒光定量 PCR檢測腫瘤組織標本中miR-150的表達，增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）法檢測癌細胞增殖情況及原位TUNEL法檢測癌細胞凋亡情況。
　?。?）HKP-miR-150在體內代謝分布規(guī)律及HKP安

5、全性評價研究
　　通過cy-3熒光染料對經(jīng)HKP包載的miR-150及未經(jīng)HKP包載的miR-150進行定性對比分析，觀察 HKP-miR-150混合制劑的在動物體內代謝以及分布情況。通過在小鼠和食蟹猴兩個動物種屬分別進行急毒和長毒試驗，對豚鼠進行皮膚過敏試驗，評價HPK試劑的安全性。
　　結果：
　?。?）瓊脂糖凝膠電泳顯示HKP與miRNA質量比為4:1時，未能檢測到游離micro RNA，確定HKP（API）與m

6、icro RNA的質量比在4:1及以上均可滿足實驗要求。激光粒度儀測量顯示，不同質量比例的HKP與micro RNA形成納米復合物粒徑電位數(shù)據(jù)均較穩(wěn)定。核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對HKP與micro RNA形成納米復合物的包封率測定結果顯示：隨著 HKP量的增加，游離 miRNA量在降低，即包封效果在遞增并且4:1的時候，游離miRNA量非常低，適合用于實驗的進一步展開。通過實時熒光定量PCR法檢測HKP-miRNA納米復合

7、物在體外對細胞靶基因的表達水平，結果顯示HKP與miRNA質量比4:1合適且有效，可以確定作為制劑配方比例。
　?。?）實驗成功建立了裸鼠皮下移植瘤動物模型（36/36）。18天給藥結束后，發(fā)現(xiàn)除了 miRNA-150治療組，其它各組都呈現(xiàn)和未治療控制組相似的生長趨勢，而miRNA-150治療組的腫瘤生長顯著減緩。從第七次治療開始，腫瘤生長明顯被抑制；定量RT-PCR檢測腫瘤組織中靶向微核酸表達水平，結果顯示HKP-miR-150

8、治療組靶向微核酸表達顯著高于其它組別；檢測經(jīng)過治療的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)增殖細胞核抗原在 HKP-miR-150 mimics治療組中，與其它對照組和未治療有顯著差別，經(jīng)過HKP-miR-150 mimics藥物治療的腫瘤組織中的PCNA細胞核大量減少，提示腫瘤細胞死亡；使用經(jīng)典細胞程序化死亡檢測的 TUNEL法，檢測經(jīng)過治療的腫瘤組織，HKP-miR-150 mimics治療組與其它對照組和未治療組有顯著差別，經(jīng)過HKP-miR-150 m

9、imics藥物治療的腫瘤組織中的TUNEL細胞核大量增加，提示治療誘導腫瘤細胞程序化死亡。
　?。?）cy-3熒光定性分析結果顯示：經(jīng)HKP包載后，miR-150在動物體內作用時間較未經(jīng)HKP包載的miR-150在動物體內作用時間顯著延長。腹腔臟器成像結果顯示：HKP-miR-150-Cy-3組小鼠小腸、結直腸、腎臟、脾臟在24h后仍有藥物富集。安全性評價結果顯示應用HKP包載體的動物均未見明顯全身急性毒性和長期反應以及皮膚過敏反

10、應，HKP載體安全劑量大于1080μg/kg。
　　結論：
　　HKP與miRNA按照4:1質量比進行混合后，游離miRNA顯著減少，可與HKP形成穩(wěn)定的復合物，同時顯著提高了miRNA在體內的穩(wěn)定性。動物藥效學實驗顯示該混合制劑通過瘤內注射可誘導腫瘤細胞程序化凋亡，有效抑制腫瘤細胞增長。安全性評價研究結果顯示HKP作為多肽聚合物，具有無毒、生物可降解性強的優(yōu)點，因此，HKP可以作為一種高效低毒的miRNA藥物載體，應用于m