大腸癌早期診斷技術(shù)

1、,博爾誠（北京）科技有限公司BioChain (Beijing) Science & Technology Inc.Feb 28, 2013,Septin9基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷,已經(jīng)獲得了國際專利；獲得了歐盟CE認(rèn)證；即將取得美國FDA認(rèn)證，完成了近萬例臨床試驗(yàn)。美國和歐洲的著名臨床檢測中心已列為常規(guī)檢測項(xiàng)目，至今已檢測幾十萬例。美國和歐洲已將此檢測列入醫(yī)療保險(xiǎn)。國內(nèi)正在進(jìn)行SFDA申報(bào)的臨床實(shí)驗(yàn)。參與國

2、內(nèi)重大課題“五癌”篩查國家項(xiàng)目，并已經(jīng)啟動(dòng)。,Epi公司Septin9基因甲基化進(jìn)行結(jié)直腸癌早期診斷的國際認(rèn)證,結(jié)直腸癌背景介紹,3,大腸簡介,大腸是消化系統(tǒng)的最后一部分，是一個(gè)長約1.5米的較粗的管狀器官。大腸由兩個(gè)主要部分組成：結(jié)腸和直腸。它們在腹部彎曲病形成一個(gè)圍繞著小腸的長方形。,4,世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率高,癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年全球約800萬人死于癌癥，其中結(jié)直腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位

3、居全球惡性腫瘤第三位，隨著人口趨向老齡化，生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等因素的影響，在西方發(fā)達(dá)國家，結(jié)直腸癌已成為僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤。結(jié)直腸癌是腫瘤中第二大殺手，每年在美國有140,000新發(fā)病例，以及每年導(dǎo)致50,000人死亡；在發(fā)達(dá)國家中，北美和歐洲發(fā)病率最高，每10萬人中就有15-20人死于結(jié)直腸癌；,中國結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率呈急劇上升趨勢,近十年發(fā)病率逐年攀升每年新發(fā)約40萬人每年死亡約19.5萬人每年

4、增速約為4.2%，遠(yuǎn)超2%的國際平均水平已從第六位躍為第三位在上海是第二位，僅次于肺癌[2],[1] 2012 中國腫瘤登記年報(bào)[2] 2013年第九屆上海國際大腸癌高峰論壇報(bào)道,結(jié)直腸癌早期篩查可以拯救生命,結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)，80%為中晚期，早期診斷的比例僅為11.8%。有效的早期篩查和干預(yù)治療可使癌的發(fā)生率下降60%，病死率下降80%,篩查可提高結(jié)直腸癌5年生存率,Epigenomics AG Corporate Pre

5、sentation 2013.1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院，上海市疾控中心李世榮, 大腸癌早期診斷的基本策略.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2007. 21(9): p. 22-25,目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：便潛血檢測 (FOBT)和糞便免疫化學(xué)法（FIT）：主要針對消化道出血；糞便樣本，采樣不方便；假陽性率高，結(jié)果穩(wěn)定性差；受檢率<3%結(jié)腸鏡檢查: 雖然是檢測金標(biāo)準(zhǔn)， 但患者對檢查有恐懼感，存在腸道出血

6、及感染等風(fēng)險(xiǎn)，依從性差； 左右半腸結(jié)果差異明顯。受檢率<5%現(xiàn)有方法受檢率低，急需更易于患者接受的早期檢測方法。,結(jié)直腸癌的方法和面臨的主要問題,便潛血（FOBT) 檢測,結(jié)腸鏡檢查,患者的需求？？？,早發(fā)現(xiàn)—能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌無創(chuàng)傷—沒有恐懼感，沒有風(fēng)險(xiǎn)高靈敏—檢出率高易采樣—不臟，不煩，不痛我們提供的方法：采10ml血樣95.6%與腸鏡吻合可檢測到I期結(jié)腸癌當(dāng)日拿到檢測結(jié)果,Septin9基因檢測項(xiàng)目

7、介紹,10,Septin9基因檢測-德國原裝進(jìn)口,,11,熒光定量PCR技術(shù) 包括 oligos, 聚合酶、和專利的緩沖液,對照是基于博爾誠提供的細(xì)胞系,基于磁珠提取及專利的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化技術(shù),用于結(jié)直腸癌的早期篩查,Septin9基因檢測-試劑盒組成,12,Septin9的生物學(xué)功能,人類Septin (SEPT) 蛋白家族成員-13個(gè),,在Septin蛋白家族中，Septin9蛋白最明顯的特征：長延伸的N端可變區(qū)非極性的

8、脯氨酸富集區(qū)缺少C端螺旋區(qū),Septin蛋白復(fù)合物的形成,Septin9 獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置缺少C端螺旋區(qū)的Septin9 蛋白，使其位于在八聚體復(fù)合中末端。暴露的Septin9 N端可變區(qū)影響復(fù)合物的整體功能。保守的Septin9 N端的脯氨酸富集區(qū)決定了復(fù)合物的非極性末端。,哺乳動(dòng)物的Septin蛋白家族形成非極性、棒狀八聚體的復(fù)合物（SEPT9-SEPT7–SEPT6–SEPT2–SEPT2–SEPT

9、6–SEPT7-SEPT9)。,Septin蛋白復(fù)合物在細(xì)胞分裂期的作用,Septin蛋白復(fù)合物參與細(xì)胞分裂的功能：Cytoskeletal scaffold （細(xì)胞骨架的支架），平行于肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（Actin filament），為參與肌球蛋白II（Myosin II）活性的分子提供附著點(diǎn)，參與Rho信號通路，涉及細(xì)胞類型和功能變化。Diffusion barrier（膜蛋白擴(kuò)散障礙），束縛跨膜蛋白和胞內(nèi)膜蛋白的無序擴(kuò)散。腫瘤

10、細(xì)胞具有很高的膜動(dòng)力學(xué)特征。若Septin9蛋白失調(diào)，Septin蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細(xì)胞分裂過程，導(dǎo)致細(xì)胞朝癌變發(fā)展,甲基化——5`甲基胞嘧啶,基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化,效應(yīng)：基因表達(dá)下降或失活，蛋白水平下降,甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件,Epigenetic changes resulting in transcriptional silencing of cancer genes are among the most fre

11、quently discovered evens in human tumor samples and altered chromain structure in 5'-regulatory region. Hypermethylation of gene promoter associated CpG islands occurs early during colorectal cancer development, sugg

12、esting its utility as a molecular marker for both early detection and monitoring progression of the disease.- Glockner, S.C., et al., Cancer Research, 2009, 69:4691-9,在基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島區(qū)域發(fā)生的甲基化事件，通常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，因此可以把甲基化作為結(jié)直腸癌早期

13、診斷和監(jiān)測疾病進(jìn)展的分子標(biāo)記物。,Septin9基因啟動(dòng)子gamma區(qū)域的甲基化導(dǎo)致該基因的表達(dá)發(fā)生改變,結(jié)直腸癌的癌變與septin9基因甲基化,游離DNA,血紅細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞,德國EpiGenomics公司專利的外周血游離DNA甲基化檢測技術(shù)提高了微量甲基化DNA檢測的靈敏度,Blocker引物屏蔽非甲基化的DNA，避免其與探針結(jié)合。特異水解探針的應(yīng)用提高了血液中甲基化基因的檢出率。,德國Epigenomics公司在世界不同國家，

14、包括中國都申請了該技術(shù)的專利,Septin9 基因甲基化結(jié)直腸癌的檢測原理,外周血采樣甲基化基因檢測熒光定量PCR法自動(dòng)化結(jié)果判讀,腫瘤細(xì)胞,正常細(xì)胞,注：CE要求是I期～Ⅳ期腫瘤病人。FDA要求腺瘤，原位癌和I期～Ⅳ期腫瘤病人。 1) Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.12) Case control study results with ARUP´s LD

15、T test published Nov 16, 2011,Septin9基因檢測-具有高靈敏和高特異,24,,國內(nèi)臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示Septin9檢測針對中國人群同樣具有高靈敏性和特異性,檢測樣本總數(shù)83例，包括47例結(jié)直腸癌和36例健康對照結(jié)果：靈敏性85.1%，特異性100%,Septin9 檢測可檢出大部分早期大腸癌,Warren, J.D., et al., Septin 9 methylated DNA is a sensi

16、tive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med, 2011. 9: p. 133.,Septin9檢測結(jié)腸左右側(cè)無差異,Grutzmann, R., et al., Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay. PLoS

17、One, 2008. 3(11): p. e3759.,注：FIT 國內(nèi)不常用。這組數(shù)據(jù)結(jié)果是Epigenomics在美國采用目前最先進(jìn)靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三天取便樣，檢測3次大便標(biāo)本。1)Chin J Gastroenterol，2001，Vo|6，No 4 244-2512) Case control study results with Epi proColon® 2.0 final pr

18、oduct published Sep 19, 2011 3) Case control study results with ARUP´s LDT test published Nov 16, 2011,Septin9基因檢測-方法對比,28,Septin9結(jié)直腸癌檢測適用于哪些人群,1）一般風(fēng)險(xiǎn)人群：大于40歲人群2）高風(fēng)險(xiǎn)人群：結(jié)直腸癌家族史和家族性腺瘤性息肉病,大于20歲人群。炎癥性腸病多年不愈、病變范圍較廣的

19、潰瘍性結(jié)腸炎化放療治療效果評估，術(shù)后檢測。建議上述人群，每年進(jìn)行一次結(jié)直腸癌早期篩查。,The Best Screening Test Is the Screening Test That Gets Done .最好的篩查項(xiàng)目是容易操作的項(xiàng)目 ----Sidney Winawer, MD Chief of Gastroenterology at Memoria

20、l Sloan Kettering Cancer Center – ASCO 2001,The Best Test Is the Test the Patients Can Get and Will Take.最好的檢測是病人能夠做并愿意做的檢測----Durado BrooksAmerican Cancer Societyhttp://www.nypcancerprevention.com/issue/12/cancer_

21、prevention/feature/acs-colon-cancer-guidelines.shtml -2009,專家評語,Septin9 結(jié)直腸癌篩查檢測周期短,Septin9 結(jié)直腸癌篩查就診流程,與腸鏡檢測“優(yōu)勢互補(bǔ)”，提高腸鏡的一次陽性檢出率與腸鏡檢測有很高的符合率,可使用的四種熒光定量PCR儀,Applied Biosystems 7500 Fast Dx配有SDS 1.4軟件帶有21 CFR part 11,Ro

22、che LightCycler 480 Instrument ISoftware Version 1.5,Roche LightCycler 480 Instrument IISoftware Version 1.5,Applied Biosystems 7500 Fast配有SDS 1.4軟件,Septin9 結(jié)直腸癌早期篩查,早發(fā)現(xiàn)、無創(chuàng)傷、高靈敏、易采樣世界上獨(dú)一無二的甲基化基因外周血檢測方法,檢測報(bào)告說明,檢測說明

23、1）臨床研究已證實(shí)血漿中檢測到Septin9基因發(fā)生甲基化與患結(jié)直腸癌存在密切相關(guān)。2）檢測結(jié)果為陽性是指存在患結(jié)直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)。接受結(jié)腸鏡檢查，以確診是否患有結(jié)直腸癌。接受我們的隨訪，進(jìn)一步診療后請?zhí)顚戨S訪信。3）檢測結(jié)果為陰性，說明沒有檢測到Septin9基因發(fā)生甲基化。無消化道不適癥狀者一年進(jìn)行一次抽血復(fù)查檢測。有消化道不適癥狀者1～3月后抽血復(fù)查此項(xiàng)檢測。,34,一、門診掛號,,二、就診確認(rèn)結(jié)直腸癌篩查試用人群,

24、,四、抽血1、交費(fèi)2、門診治療室抽血（10ml）,三、檢查體格等常規(guī)檢查問診以確定臨床信息,,五、登記1、資料掃描存檔2、簽署知情同意書,,,六、送標(biāo)本將靜脈血、受檢者臨床信息送至博爾誠醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,,七、Septin9甲基化檢測,八、發(fā)送報(bào)告郵寄、E-mail、傳真等,,,,九、結(jié)果解讀收到報(bào)告后醫(yī)生進(jìn)行結(jié)果解讀,Septin9基因檢測-就診流程,35,一、體檢中心,36,文獻(xiàn)發(fā)表,37,文獻(xiàn)發(fā)表,SCI 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),