Trop--2 CAR-T細(xì)胞的制備及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞殺傷作用的研究.pdf

1、卵巢癌早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，因此常常進(jìn)展至晚期階段才被發(fā)現(xiàn)，其五年生存率不到30％，是女性生殖系統(tǒng)腫瘤最常見(jiàn)的死因，嚴(yán)重威脅著女性的生命安全[1]。目前，卵巢癌治療主要采取手術(shù)治療輔以化療的聯(lián)合療法，但是超過(guò)70％的卵巢癌患者于初次治療后復(fù)發(fā)，并易對(duì)化療產(chǎn)生耐受或抵抗作用，因此，迫切需要探尋新的卵巢癌臨床治療方法[2]。
　　嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell immunothe

2、rapy，CAR-T）技術(shù)是基于抗體靶向技術(shù)的免疫治療新方法，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療領(lǐng)域取得的突破性進(jìn)展初步證實(shí)了其治愈腫瘤的潛力，使其成為近年來(lái)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。受到CAR-T技術(shù)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療領(lǐng)域成功應(yīng)用的鼓舞，CAR-T技術(shù)在實(shí)體瘤治療領(lǐng)域的研究也相繼展開(kāi)，涉及間皮瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤類型，其中CAR-T技術(shù)在治療腦膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究中取得了顯著的治療效果[3-4]。
　　C

3、AR-T技術(shù)依賴抗體與抗原的特異性結(jié)合，使T細(xì)胞精準(zhǔn)靶向表達(dá)目標(biāo)抗原的腫瘤細(xì)胞，因此，合適的靶抗原是CAR-T技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。理想的靶抗原應(yīng)該具備在腫瘤組織中高表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)的特點(diǎn)[5]。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen2，Trop-2)是一種由人TACSTD2基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白[6]。研究表明，Trop-2是一種腫瘤相關(guān)蛋白，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、

4、轉(zhuǎn)移及疾病的預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。Trop-2在卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而在人正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)[7,9]，在腫瘤的靶向治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究選取Trop-2作為靶點(diǎn)，制備靶向Trop-2的CAR-T細(xì)胞并檢測(cè)其對(duì)Trop-2表達(dá)陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用，為卵巢癌的治療提供新的方法。
　　方法:
　　1.Trop-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及分析

5、　　以抗Trop-2 Fab及Linker(Gly4Ser)3為模板，根據(jù)In-Fusion PCR原理設(shè)計(jì)Vκ，VH的擴(kuò)增引物;擴(kuò)增Vκ，VH片段并將其與Linker(Gly4Ser)3連接成Vκ-(Gly4Ser)3-VH基因片段（抗Trop-2 scFv）;使用限制性核酸酶雙酶切包含人IgG CH2CH3以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)CD28、CD137、CD3ζ基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(SFG.CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ)

6、;應(yīng)用In-Fusion PCR的方法將抗Trop-2scFv與線性化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體連接起來(lái)，構(gòu)建成第三代Trop-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒（Trop-2 CAR質(zhì)粒），對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序分析;使用293fectinTM Transfection Reagent將Trop-2 CAR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，并通過(guò)Western Bolt檢測(cè)其在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　2.Trop-2 CAR-T細(xì)胞的制備

7、r>　　運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建Trop-2 CAR-GFP質(zhì)粒，并通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)病毒包裝時(shí)的轉(zhuǎn)染效率;通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)、293fectinTM Transfection Reagent及293T細(xì)胞制備Trop-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒上清;病毒上清經(jīng)100 kD超濾管濃縮后，采用qPCR方法檢測(cè)病毒滴度;用濃縮后的Trop-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T細(xì)胞，獲取Trop-2 CAR-T細(xì)胞并于體外擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　3.Trop-

8、2 CAR-T細(xì)胞體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用
　　以轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞和CD19 CAR-T細(xì)胞作為陰性對(duì)照，采用CCK-8法檢測(cè)靶向Trop-2 CAR-T細(xì)胞對(duì)Trop-2抗原表達(dá)不同的卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、HO8910、SKOV3、A2780，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞A375的殺傷作用;采用ELISA法檢測(cè)Trop-2 CAR-T細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-2分泌的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Trop

9、-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及分析
　　通過(guò)PCR擴(kuò)增抗Trop-2的Vκ和VH基因片段分別為350bp和400bp左右;構(gòu)建的Trop-2 CAR質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)，其序列與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列一致;Western Bolt檢測(cè)結(jié)果表明，該Trop-2 CAR質(zhì)粒能夠在293T細(xì)胞中有效表達(dá)。
　　2.Trop-2 CAR-T細(xì)胞的制備
　　通過(guò)GFP示蹤轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下顯示病毒包裝的轉(zhuǎn)染效率達(dá)80

10、％;病毒上清經(jīng)超濾濃縮10倍后的病毒含量均超過(guò)1.5×109 copies/ml;
　　3.Trop-2 CAR-T細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用
　　Trop-2 CAR-T細(xì)胞對(duì)Trop-2表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用隨效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例(E∶T)的增加而增強(qiáng)，當(dāng)E∶T為20∶1時(shí)，Trop-2 CAR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)不同水平Trop-2的卵巢癌細(xì)胞的殺傷效率范圍為50％-85％(P＜0.05)，而各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)Trop-2表

11、達(dá)陰性的腫瘤細(xì)胞的殺傷效率間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Trop-2 CAR-T細(xì)胞與Trop-2表達(dá)陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞的共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌量明顯高于CD19 CAR-T細(xì)胞組和T細(xì)胞組(P＜0.01)，而各組效應(yīng)細(xì)胞與Trop-2表達(dá)陰性腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建Trop-2 CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，其可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病