丙泊酚對卵巢癌細胞侵襲和紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡的作用中轉(zhuǎn)錄因子Slug的影響.pdf

1、背景和目的:
　　卵巢癌(OVCA)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。由于卵巢在盆腔內(nèi)位置較深，卵巢癌早期又缺乏特異性癥狀，卵巢癌已是女性死于癌癥相關(guān)疾病的第五大原因，是幾十年困擾臨床醫(yī)生和研究者的難題。這主要是由于缺少疾病的早期檢測方法，導(dǎo)致原發(fā)腫瘤快速地具有侵略性地細胞腹膜擴散，致使大多數(shù)患者的不良預(yù)后。獲得遷移和侵襲能力是公認的卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的一個必要的先決條件，但導(dǎo)致卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的確切分子機理尚未得到很好的闡明。
　　

2、化療藥物耐藥性是腫瘤治療中一個嚴峻的問題，因為許多腫瘤對使用的一些細胞毒試劑本質(zhì)上是耐受的，而其余腫瘤，盡管它們最初是敏感的，在重復(fù)使用抗腫瘤試劑后，最終對抗腫瘤試劑產(chǎn)生耐受性。對卵巢癌，在腫瘤的最佳切除手術(shù)和標(biāo)準化療后，晚期疾病患者增加5年生存率。盡管卵巢癌對化學(xué)治療相對敏感，但臨床上化學(xué)治療經(jīng)常遭遇耐藥性。這種獲得性耐藥性的發(fā)展成為成功治療的主要限制。因此，迫切需要確定腫瘤細胞對化療藥物耐藥機制以研制新的藥物重新提高腫瘤細胞對主要化

3、療的靈敏度。
　　近期對食管鱗狀細胞癌，膀胱癌，胰腺癌和卵巢癌的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Slug是侵襲過程和致癌過程中的重要操縱子。在膽管癌細胞中，Slug沉默能夠增強細胞對順鉑和輻射的敏感性。在卵巢癌中，Slug也能調(diào)控抗輻射和藥物抗性。因此，我們認為Slug可能是一個有效的基因靶。
　　丙泊酚（2，6—二異丙基苯酚），是一種能夠產(chǎn)生平穩(wěn)誘導(dǎo)且能迅速蘇醒的最常用的靜脈麻醉藥，自上世紀八十年代末引進國內(nèi)，現(xiàn)已廣為接受。除了具有多種

4、麻醉優(yōu)越性，丙泊酚還能發(fā)揮一些非麻醉劑的作用。丙泊酚可通過調(diào)節(jié)Rho A抑制癌細胞的侵襲能力，暗示它可能是癌癥手術(shù)中完美的麻醉劑。在肺癌細胞中，體外實驗證明丙泊酚可阻止MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達，從而抑制侵襲和遷移。在結(jié)腸癌細胞中，丙泊酚促進抑制癌細胞的侵襲部分是由于ERK1/2-依賴的金屬蛋白酶減量調(diào)節(jié)。我們最近報道了丙泊酚使NF-κB信號通路失活可以廢除吉西他濱誘導(dǎo)的NF-κB活性活化，結(jié)果導(dǎo)致了胰腺腫瘤的化療增敏

5、作用。然而，在膽囊癌中，丙泊酚卻通過活化Nrf2誘導(dǎo)增殖和促進入侵。
　　在本研究中，我們用對紫杉醇敏感的和耐藥的卵巢癌細胞株在體外檢測了丙泊酚對細胞侵襲和誘導(dǎo)細胞凋亡的影響，同時觀測slug水平與之相關(guān)性。以期探明丙泊酚是否對卵巢癌細胞侵襲具有抑制作用;是否能夠促進紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡;轉(zhuǎn)錄因子Slug是否是丙泊酚抑制卵巢癌細胞侵襲并促進紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細胞凋亡的一個有效的基因靶。
　　材料和方法:
　　1.

6、細胞與細胞培養(yǎng)
　　人卵巢癌細胞株HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2。SKOV-3和OVCAR-3細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，加10％熱滅活胎牛血清，50μg/mL慶大霉素和1mmol/L丙酮酸鈉。HO-8910PM，HO-8910，COC1和ES-2培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基中，加10％胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素和1％L-谷氨酰胺。所有的細胞都是在37℃含有5％的CO2的細胞培養(yǎng)箱中

7、。
　　2.藥物暴露
　　將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板，5×103個細胞/孑。孵育24小時后，用含有一系列濃度紫杉醇(0.01-10μmol/L)或丙泊酚（0.1-10μg/mL）的含5％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時做劑量依賴分析。時間依賴的測定，5×103個細胞/孔在含10μmol/L紫杉醇或5μg/mL丙洎酚的5％胎牛血清MEM培養(yǎng)基中孵育24-72h。采用MTT法測定剩余活細胞的相對數(shù)。TU

8、NEL染色法檢測細胞凋亡。
　　3.化學(xué)敏感性試驗
　　細胞接種于96孔板，5×103個細胞/孔。孵育24小時后，培養(yǎng)基替換為含5μg/ml丙泊酚的5％胎牛血清MEM，額外孵育24小時，將細胞暴露于0.1μmol/L的紫杉醇溶液48小時。剩余活細胞的相對數(shù)量采用MTT法測定。TUNEL染色法檢測凋亡細胞。
　　4.MTT實驗
　　5×103個細胞/孔種板，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，按上述方法作用標(biāo)示時間后，每孔添加10

9、μL MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-二苯基溴化物），避光培養(yǎng)4小時。吸出培養(yǎng)基MTT混合物，每孔添加150μL MTT溶劑（0.1N鹽酸無水異丙醇）。室溫搖床孵育10分鐘，用移液管充分混合直到所有的甲晶體溶解。以690 nm處的吸光度為背景測量570 nm的吸光度變化。從570 nm的吸收值減去690 nm的吸收值以獲得最終的吸收值。
　　5.TUNEL實驗
　　上述細胞1×104

10、個，在指定的時間移至玻片培養(yǎng)24小時。細胞凋亡根據(jù)制造商的說明用TUNEL法評價。所有試驗均一式四份。
　　6.細胞侵襲實驗
　　侵襲實驗，HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞，用0.1-10微克/毫升丙泊酚處理72小時，或5微克/毫升的丙泊酚處理24-72小時。然后2×103個上述細胞在無血清培養(yǎng)基中添加到每個插條的內(nèi)部。板在5％的二氧化碳中37℃孵育24小時后，將插條中

11、的介質(zhì)移除，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗插條。插條膜用冷甲醇固定10分鐘，在25％甲醇中用0.5％結(jié)晶紫染色10分鐘，水沖洗除去多余的染料。將膜從插條內(nèi)移出，放在顯微鏡下，清點遷移通過多孔膜的細胞數(shù)量。
　　7.蛋白質(zhì)印跡分析
　　蛋白質(zhì)印跡分析，用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞二次，并在細胞裂解液中裂解30分鐘。樣品超聲處理30秒，離心力12000×g，4℃離心20 min。樣品經(jīng)12％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后在硝

12、酸纖維素膜上電泳印跡。膜被阻擋在含5％牛奶的TBS/吐溫-20緩沖液，并和稀釋在TBS/吐溫-20/BSA（牛血清白蛋白）中的初次抗體在4℃下孵育一夜。隨后的要素是抗-slug。所有印跡與結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)(2000/1)的二抗一起孵育，使用增強的化學(xué)發(fā)光法(ECL)培養(yǎng)。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。
　　8.統(tǒng)計分析
　　統(tǒng)計上的顯著差異由配對t檢驗和單因素方差分析檢測，定義P＜0.05。所有實驗均獨

13、立地重復(fù)至少三次。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢癌(OC)細胞系對紫杉醇耐藥性的變化
　　我們體外研究了六個卵巢癌細胞系(HO-8910PM， HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2)對紫杉醇的相對靈敏度。卵巢癌細胞用不同濃度的紫杉醇處理72小時，存活細胞數(shù)用MTT法分析。由此，對HO-8910PM，OVCAR-3和SKOV-3細胞，紫杉醇的LD50＞10微摩爾/升，HO-8910，COC1和ES

14、-2細胞的LD50為0.1微摩爾/升左右。當(dāng)用TUNEL法分析紫杉醇對細胞凋亡的影響時獲得同樣敏感性。這些數(shù)據(jù)支持將HO-8910PM，OVCAR-3和SKOV-3細胞株對紫杉醇耐藥，HO-8910，COC1和ES-2細胞株對紫杉醇敏感的分類。
　　2.卵巢癌細胞系的slug水平
　　為了檢驗slug基底水平可以預(yù)測紫杉醇的敏感性這一假設(shè)，我們最初通過蛋白質(zhì)印跡試驗評估卵巢癌細胞系slug水平。Slug蛋白含量最高的是HO-

15、8910PM，OVCAR-3和SKOV-3細胞，slug蛋白水平最低的是HO-8910，COC1和ES-2細胞。因此，卵巢癌細胞表現(xiàn)出升高的slug，耐藥細胞對敏感性細胞株有一致的slug模式，紫杉醇敏感細胞對紫杉醇耐藥細胞slug有一致的差異。
　　3.紫杉醇治療增加敏感細胞中slug的表達但對耐藥細胞無作用
　　HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞分別以0.001，0.

16、01，0.1，1，10微摩爾/升紫杉醇處理24小時，用蛋白質(zhì)印跡法檢測slug。用0.001-10微摩爾/升紫杉醇處理24小時對耐藥的HO-8910PM， OVCAR-3，SKOV-3細胞中slug水平無顯著影響。然而，對紫杉醇敏感的HO-8910，COC1和ES-2細胞，用0.1微摩爾/升的紫杉醇處理24小時slug的水平顯著增加。
　　4.丙泊酚治療可抑制耐藥細胞的細胞侵襲但不作用于敏感細胞
　　全身麻醉丙泊酚血漿靶濃度

17、在3至8μg/mL之間。在本研究中，卵巢癌HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞用0.1-10μg/mL丙泊酚處理72小時，或5μg/mL的丙泊酚處理24-72小時。抑制入侵的劑量依賴方式和時間依賴方式-在紫杉醇耐藥的卵巢癌HO-8910PM，OVCAR-3，SKOV-3細胞，5-10μg/mL丙泊酚的濃度足以抑制癌細胞的侵襲能力。而在紫杉醇敏感細胞HO-8910，COC1和ES-2中丙

18、泊酚的抑制效應(yīng)不明顯。
　　5.丙泊酚治療可抑制耐藥細胞的細胞增殖和促進細胞凋亡但對敏感細胞不起作用
　　HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞經(jīng)0.1-10μg/mL丙泊酚處理24、48和72小時。丙泊酚降低紫杉醇耐藥細胞HO-8910PM，OVCAR-3，SKOV-3的增殖，MTT法檢測其具有時間依賴和劑量依賴行為。用TUNEL法進行細胞凋亡分析，丙泊酚促進紫杉醇耐藥細胞

19、HO-8910PM，OVCAR-3和SKOV-3的凋亡。在紫杉醇敏感的HO-8910，COC1和ES-2細胞中無顯著效果。
　　6.紫杉醇治療后丙泊酚對耐藥性和敏感性細胞中的slug均能抑制
　　因為5μg/mL丙泊酚處理48小時后能顯著抑制卵巢癌細胞侵襲并促進卵巢癌細胞凋亡。因此，我們用5μg/mL丙泊酚處理48小時做進一步的研究。HO-8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞經(jīng)5

20、μg/mL丙泊酚處理48小時。細胞中Slug蛋白顯著地或完全地被抑制。雖然0.1μmol/L紫杉醇治療24小時后顯著增加了對紫杉醇敏感的HO-8910，COC1和ES-2細胞的slug水平，5μg/mL丙泊酚預(yù)處理則完全抑制0.1μmol/L紫杉醇治療48小時后Slug蛋白。
　　7.丙泊酚增強紫杉醇對耐藥和敏感細胞誘導(dǎo)的細胞凋亡
　　丙泊酚治療會增加卵巢癌細胞系對紫杉醇促成的細胞凋亡的敏感性，為了檢驗這一假設(shè)，卵巢癌HO-

21、8910PM，HO-8910，SKOV-3，OVCAR-3，COC1和ES-2細胞用5μg/mL丙泊酚預(yù)處理24小時，然后檢測其單獨作用及其和0.1μmol/L濃度的紫杉醇的聯(lián)合作用。丙泊酚聯(lián)合0.1μmol/L濃度的紫杉醇治療顯著降低細胞數(shù)且在體外增加所有卵巢癌細胞的細胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚治療可抑制卵巢癌細胞侵襲和促進卵巢癌細胞凋亡，并促進紫杉醇殺死所有對紫杉醇敏感的和耐藥的卵巢癌細胞。觀察到基