TLR4對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性影響的實驗研究.pdf

1、研究背景: Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是一類跨膜蛋白，最初從果蠅胚胎發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)。哺乳類動物與果蠅的TLRs具有高度的同源性。TLRs的主要特征是細胞外富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)，是白介素-1受體（IL-1R）超家族的一員，在宿主的天然免疫應(yīng)答中起哨兵樣作用，在人的細胞中發(fā)現(xiàn)有十種表達亞型。不同亞型識別不同配子，啟動各自的信號傳導(dǎo)。 卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖

2、系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅婦女的生命和健康。在卵巢惡性腫瘤中，近70％患者在確診時已是進展期或已有轉(zhuǎn)移。卵巢癌治療的重要手段是手術(shù)治療和以紫杉醇、鉑類等為主的聯(lián)合化療。紫杉醇（Paclitaxel，Pac）是從太平洋紫杉屬短葉（Taxus brevifolia）紫杉中提取的一種抗癌新藥。Pac作用于β微管蛋白N端第31個氨基酸上，促進微管蛋白聚合并抑制其解聚，使細胞周期移行阻斷在G2/M期，促使細胞死亡；美國的臨床研究表明Pac對卵

3、巢癌及乳腺癌有突出療效，被譽為近15年來最好的抗腫瘤新藥。Pac作為一線的化療藥物主要用于治療卵巢癌，而腫瘤細胞對Pac耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，使卵巢癌患者總的五年生存率僅為40％左右。 文獻報道在卵巢上皮癌組織及細胞系中，TLR4為陽性表達。研究表明：Pac與TLR4信號傳導(dǎo)存在內(nèi)在聯(lián)系，Pac是TLR4的一個潛在配體。TLR4對卵巢癌細胞中Pac治療作用的影響，Kelly等的研究顯示：Pac啟動TLR4/MyD88信號傳

4、導(dǎo)，激活了蛋白激酶C（Akt/PKC），并進一步導(dǎo)致了NF-κB活化。TLR4通路的下游信號因子TAB1（TAK1-binding protein1）可促進X連鎖的凋亡抑制蛋白（XIAP）水平升高，而XIAP通過下調(diào)caspase-8表達而抑制TRAIL的凋亡途徑。 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源

5、mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi主要通過轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達，可以在研究基因的功能方面應(yīng)用。同時可以通過關(guān)閉非必需或致病基因而改變?nèi)梭w的基因表達。哺乳動物中通過RNAi機制實現(xiàn)基因表達的抑制有多種策略，其中以構(gòu)建小干擾RNA（small intereference RNA，siRNA）表達載體的方法最為穩(wěn)定和持久。為此，尋找合適的靶基因進行RNAi，可以更細致的探討腫瘤細胞復(fù)雜的生物學行為。 本研究擬通過運用RNAi技

6、術(shù)沉默TLR4基因的表達，探討干擾TLR4后卵巢癌細胞對Pac敏感性的影響和發(fā)生機制，為提高Pac治療卵巢癌的療效尋找新途徑，并為卵巢癌的臨床治療提供新的靶點。本研究分兩部分：一、構(gòu)建TLR4 shRNA表達質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞并鑒定TLR4基因的沉默效果。二、探討TLR4對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性影響的作用機制。 第一部分: RNAi表達載體的構(gòu)建及沉默TLR4基因的效果鑒定 研究目的： 應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建

7、針對TLR4的shRNA真核表達載體并轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞，鑒定沉默TLR4基因的效果。 研究方法： 1.應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建TLR4的shRNA真核表達載體 （1）參閱已被文獻證明有效的TLR4特異性siRNA序列：正義鏈為5'-CGATGAT ATTATTGACTTA-3'；反義鏈5'-TAAGTCAATAATATCATCG-3'。陰性對照選擇與人類基因沒有任何同源的干擾序列，正義鏈5'-GACTTCATAAGGCG

8、CATGC-3'；反義鏈5'-GCATGCGCCTTATGAAGTC-3'。（2）siRNA插入模板的設(shè)計：根據(jù)TLR4siRNA設(shè)計針對其編碼區(qū)的DNA寡核苷酸鏈，序列為：5'-GATCCCGAT GATATTATTGACTTATTCAAGACGTAAGTCAATAATATCATCGTTTTTTGTCGA CA-3'。以同樣方式設(shè)計陰性對照引物，序列為：5'-GATCCGACTTCATA AGGCG CATGCTTCAAGACGGCA

9、TGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3'。（3）載體與siRNA鏈連接：線性化質(zhì)粒載體pGenesil-1與siRNA模板鏈連接，合成重組質(zhì)粒分別命名為pGenesil-shTLR4（目的重組質(zhì)粒）和pGenesil-shControl（陰性對照重組質(zhì)粒）。（4）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與提?。簩⒅亟M體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選卡那霉素（kanar）抗性的陽性克隆，提取質(zhì)粒。（5）酶切鑒定及DNA測序：對構(gòu)建的表達載體質(zhì)粒

10、pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl分別用SalI做酶切鑒定及DNA測序。 2.重組質(zhì)粒pGenesil-shTLR4、pGenesil-shControl分別轉(zhuǎn)染SKOV3及A2780細胞，檢測TLR4基因的沉默效果 （1）采用脂質(zhì)體（Lipofectamin）2000介導(dǎo)重組質(zhì)粒pGenesil-shTLR4、pGenesil-shControl轉(zhuǎn)染SKOV3、A2780細胞，G418篩

11、選陽性克隆。（2）RT-PCR及Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TLR4 shRNA質(zhì)粒的SKOV3和A2780中TLR4和MyD88的mRNA及蛋白表達水平。 結(jié)果： 1.TLR4shRNA重組質(zhì)粒載體酶切鑒定及DNA測序 （1）構(gòu)建的pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察到被SalI酶切出一條約400bp的陽性帶。pGenesil-shTLR4和

12、pGenesil-shControl的重組質(zhì)粒均符合設(shè)計要求。（2）重組質(zhì)粒pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的DNA測序結(jié)果通過DNAssist2.2軟件進行比對，與預(yù)先設(shè)計結(jié)果完全相符。 2.TLR4基因的沉默效果鑒定 （1）經(jīng)G418篩選，4周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的SKOV3及A2780的陽性克隆。（2）RT-PCR， W

13、esternblot檢測結(jié)果表明：在親代的SKOV3及A2780細胞中，TLR4在mRNA及蛋白水平均陽性表達，而MyD88在SKOV3中陽性表達（MyD88+），在A2780中幾乎不表達（MyD88-）；在目的質(zhì)粒（pGenesil-shTLR4）轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SKOV3和A2780后，兩種細胞中的TLR4mRNA及蛋白的表達水平較轉(zhuǎn)染前均明顯降低。 結(jié)論： 1.應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGenesil-shT

14、LR4和pGenesil-shControl，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序證實構(gòu)建成功。 2.pGenesil-shTLR4的質(zhì)粒載體可以穩(wěn)定的干擾卵巢癌細胞株SKOV3、A2780中TLR4基因的表達。 第二部分:TLR4對卵巢癌細胞紫杉醇敏感性影響的實驗研究 研究目的： 1.檢測卵巢癌細胞SKOV3、A2780中caspase3/7活性的表達、細胞生長抑制率、細胞周期的變化，觀察干擾TLR4基因前后SKOV

15、3、A2780細胞對紫杉醇作用敏感性的變化。 2.檢測SKOV3、A2780細胞凋亡通路中相關(guān)蛋白的表達水平，探討干擾TLR4基因后卵巢癌細胞紫杉醇作用敏感性變化的相關(guān)發(fā)生機制。 研究方法： 1.采用Caspase-Glo3/7熒光檢測法檢測紫杉醇作用24h后，轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒的SKOV3細胞（SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl）及A2780細胞（A2780/shTLR4、A278

16、0/shControl）中Caspase-3/7活性的表達。 2.采用四甲基偶氮唑鹽（Dimethylthiazol-2-yl-diphenyl tetrazalium bromide，MTT）法，檢測紫杉醇對轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒的SKOV3細胞（SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl）及A2780細胞（A2780/shTLR4、A2780/shControl）的生長抑制率（Growth inhibito

17、ry rate，GIR）的影響。 3.流式細胞術(shù)（FCM）檢測紫杉醇作用24h后，卵巢癌細胞SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl及A2780/shTLR4、A2780/shControl的細胞周期的分布情況。 4.Western blot檢測紫杉醇作用24h后，卵巢癌細胞SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl及A2780/ shTLR4、A2780/shControl細胞中凋亡相關(guān)蛋