白細(xì)胞介素18誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖道惡性腫瘤中占第3位，但其死亡率最高。它具有以下特點(diǎn)：(1)缺乏有效的早期診斷手段，2/3病例確診時(shí)已是中晚期；(2)現(xiàn)有的治療手術(shù)(手術(shù)+放化療)對(duì)中晚期患者療效差，預(yù)后差，五年生存率長期徘徊在30％，Ⅳ期僅為0-5％；(3)晚期常局限于腹腔，以盆腹腔種植和淋巴轉(zhuǎn)移為主，較少發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。免疫治療是近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，為卵巢癌的治療開辟了新的領(lǐng)域。目前卵巢癌的免疫治療包括局部和系統(tǒng)的細(xì)胞因子療法、預(yù)防性和

2、治療性疫苗、過繼性免疫治療和單克隆抗體療法等。 白細(xì)胞介素18(Interleukin-18,IL-18)是近年發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞因子，具有誘生干擾素-γ(interferon-gamma,INF-γ)，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)細(xì)胞和T細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(tumor-specific cytolytic T tymphocytes，CTLs)活性，增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞毒作

3、用等多種生物學(xué)功能，是一種應(yīng)用前景較好的抗腫瘤細(xì)胞因子。 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨癌及黑色素瘤的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中證明：IL-18能增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，其抗腫瘤作用可能是通過Fas/FasL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。Fas/FasL是傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)的受體、配體對(duì)之一。因此，如何實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控，是當(dāng)前腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)的目的是：(1)探討IL-18是否對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡有直接誘導(dǎo)作用；(2)探討Fas/

4、FasL，途徑在IL-18誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用。 第一部分 IL-18誘發(fā)卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究 材料和方法: 1、荷卵巢癌裸鼠動(dòng)物模型人卵巢染液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株(HO-8910)，4-6周齡雌性BALB/cnu/nu裸鼠。將大量培養(yǎng)的HO-8910細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.08×10<'8>個(gè)/ml，用7號(hào)針頭抽吸，注入裸鼠后項(xiàng)中間皮下，接種細(xì)胞濃度為4.5×10<'6>/100μl，建立荷人卵巢染液性乳頭

5、狀囊腺癌皮下移植瘤模型(約0.5cm大小周徑皮下移植瘤、腫瘤切片病理提示為漿液性乳頭狀囊腺癌)。共24只建模成功的荷卵巢癌裸鼠模型動(dòng)物納入研究。 2、分組實(shí)驗(yàn)將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。種植后7天開始腹腔注射IL-18 100)μl，每天1次，共7天。治療①組IL-18 0.25μg/100μl，治療②組IL-18 0.5μg/100μl，治療③組IL-18 1μg/100μl；對(duì)照組為磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)空白對(duì)照。

6、治療結(jié)束后觀察2周，處死裸鼠，取皮下移植瘤制成標(biāo)本。 3、凋亡細(xì)胞形態(tài)觀察每組各取2例部分新鮮標(biāo)本作電鏡觀察，觀察電鏡下細(xì)胞凋亡變化并攝像。 4、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞 4組共24例皮下移植瘤標(biāo)本制成石蠟切片，采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果判定：凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，陰性者細(xì)胞核呈藍(lán)色。利用HMIAS-2000高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)，每張切片選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的腫瘤細(xì)

7、胞數(shù)，然后再計(jì)數(shù)其中凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)。每視野腫瘤細(xì)胞數(shù)中凋亡細(xì)胞所占的百分比，即為凋亡指數(shù)(apoptotic indexes，AI)。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù))×100％。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均利用SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析和統(tǒng)計(jì)。采用方差檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水平α=0.05)。 結(jié)果: 1、透射電鏡結(jié)果顯示：治療③組卵巢癌細(xì)胞多腫脹，細(xì)胞膜破碎，胞漿脫落，細(xì)胞核

8、裸露；治療①組和治療②組卵巢癌細(xì)胞呈現(xiàn)較多細(xì)胞凋亡樣改變：細(xì)胞胞漿呈空泡，染色體邊集，核仁固縮，胞質(zhì)呈片狀脫落。 2、凋亡指數(shù)AI：治療①組(227.67±66.99)％，治療②組(522.17±73.44)％，治療③組(269.67±57.18)％，對(duì)照組細(xì)胞(7.67±3.35)％。即各治療組的AI均高于對(duì)照組，差異均有顯著性(P<0.01)。 第二部分白細(xì)胞介素18治療后卵巢癌細(xì)胞表面Fas/FasL表達(dá)水平的研究

9、 材料和方法: 1、免疫組化SP法(streptavavidin peroxidase immunohistochemical method)檢測(cè)癌細(xì)胞上Fas/Fasl，將24例標(biāo)本的石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，按SP法操作步驟進(jìn)行操作。參照Birner等報(bào)道的方法，每張切片隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)視野(倍數(shù)x400)，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量處理。Fas和FasL陽性顯色為黃色或棕黃色顆粒，主要為胞膜和胞漿

10、著色，染色強(qiáng)度按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：著色弱但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照者為1分，染色清晰者為2分，染色強(qiáng)者為3分；陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的10％～50％者為2分，51％～80％者為3分，>80％者為4分。上述兩項(xiàng)評(píng)分相加，不管其染色強(qiáng)度，只要陽性細(xì)胞數(shù)<10％者為(-)；3分為弱陽性(+)；4～5分為中陽性(++)；6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均利用SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析和統(tǒng)計(jì)。采用等級(jí)

11、資料多樣本秩和檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水平α=0.05)。 結(jié)果: 1、Fas表達(dá)對(duì)照組癌細(xì)胞的Fas呈低表達(dá)，治療組癌細(xì)胞的Fas表達(dá)增高；治療三組卵巢癌細(xì)胞Fas表達(dá)水平分別明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)；治療②組卵巢癌細(xì)胞Fas表達(dá)水平最高，明顯高于治療①組和治療③組，差異有顯著性(P<0.05)； 2、FasL表達(dá)對(duì)照組癌細(xì)胞FasL呈高表達(dá)，各治療組屯癌細(xì)胞FasL表達(dá)下降，與對(duì)照組比較均差異均有顯著意