白細胞介素-35促進T淋巴細胞凋亡機制的研究.pdf

1、目的:1.觀察白細胞介素-35(IL-35)對T淋巴細胞凋亡的影響。2.探討IL-35在影響T淋巴細胞凋亡中的時間、劑量關(guān)系。3.探討IL-35促進T淋巴細胞凋亡作用機制。
　　方法:采用Clone E6-1人類T淋巴細胞白血病細胞（T細胞系Jurkat，中國科學(xué)院細胞資源庫提供），作為實驗對象。用含有10％FBS RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每48h更換細胞培養(yǎng)液，72h進行細胞傳代。以每毫升1×106數(shù)量級細胞作為實驗需要標準

2、樣品。從上述樣品中取1×106/ml細胞分別接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，應(yīng)用不同刺激濃度(10ng/ml，80ng/ml，640ng/ml)白細胞介素-35(IL-35)與其分別共培養(yǎng)24h，36h。在達到時間點后，收集細胞，并將細胞分成N組(Normal)、C組(Control)、10ng/ml組、80ng/ml組、640ng/ml組。實驗一:應(yīng)用流式細胞檢測技術(shù)，使用美國BD公司AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒，應(yīng)用流式細胞儀

3、檢測細胞凋亡率。并進行統(tǒng)計學(xué)分析，解釋凋亡現(xiàn)象。實驗二:選取24h10ng/ml組、80ng/ml組、640ng/ml組，為實驗對象。應(yīng)用Western Blot方法檢測B細胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)表達情況、Akt Ser473位點磷酸化情況。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測各組caspse-3，8，9的蛋白表達變化情況。進行統(tǒng)計學(xué)分析，解釋其意義。實驗三、應(yīng)用流式細胞檢測技術(shù)，使用abcom公司的Fluo-3 AM鈣離子探針檢測上述各組的

4、細胞內(nèi)Ca2+濃度，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:1.IL-35促進T淋巴細胞凋亡，并存在時間/劑量關(guān)系。實驗結(jié)果表明，加入IL-35與Jurkat細胞共培養(yǎng)24h、36h與正常組（N組）及對照組（C組）比較凋亡率均升高(P＜0.01)。24h、36h在10ng/ml濃度IL-35的刺激下，與N組及C組比較可出現(xiàn)凋亡率上升的現(xiàn)象(P＜0.01)。在10ng/ml、80ng/ml的IL-35相同濃度下，36h的凋亡率高于24h(P＜

5、0.01)，640ng/ml的IL-35相同濃度下，24h的凋亡率高于36h(P＜0.01)。24h相同時間點，隨IL-35濃度的增加(80ng/ml、640ng/ml)與N組及C組比較凋亡率呈上升趨勢(P＜0.01);在IL-35濃度達到640ng/ml時，凋亡率達到最高，如圖1。36h相同時間點，凋亡率隨著IL-35濃度的增加，在80ng/ml時凋亡率達到最高，如圖1。
　　2.檢測24h，10ng/ml、80ng/ml、64

6、0ng/ml組的Bcl-2蛋白及AktSer473的磷酸化表達。10ng/ml組Bcl-2蛋白與Control組比較表達降低(P＜0.05)。且隨IL-35濃度增加，Bcl-2蛋白與Control組比較表達呈逐漸下降趨勢(P＜0.01)。640ng/ml時，Bcl-2蛋白的與Control組比較，表達顯著下降，并達到最低值(P＜0.01)。80ng/ml組、640ng/ml組AktSer473磷酸化與Control組比較表達明顯受到抑制

7、，且在IL-35640ng/ml時磷酸化表達與Control組比較達到最低(P＜0.01)。
　　3.檢測24h，10ng/ml、80ng/ml、640ng/ml組的Caspase-3，8，9。與Normal、Contral組比較，Caspase3，9的表達從10ng/ml開始升高，640ng/ml時與Control組比較均達到最高峰值(P＜0.01）。Caspase-8在此凋亡過程中幾乎不表達，如圖7。
　　4.檢測24h

8、，10ng/ml、80ng/ml、640ng/ml組的細胞內(nèi)Ca2+濃度變化。細胞內(nèi)Ca2+濃度隨IL-35濃度升高呈上升趨勢，且在640ng/ml刺激濃度時，達到峰值，如圖8。
　　結(jié)論:1.IL-35促進T淋巴細胞凋亡，并受時間、劑量關(guān)系影響。2.IL-35促T淋巴細胞凋亡作用機制中，相關(guān)細胞凋亡因子:Bcl-2，Caspase-3，9、細胞內(nèi)Ca2+及AktSer473磷酸化住點變化與IL-35存在量效關(guān)系。3.IL-35促