雷公藤甲素干預(yù)白細(xì)胞介素13誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的作用研究.pdf

1、足細(xì)胞是微小病變腎病(MCD)和局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)腎組織病變形成的主要受損靶細(xì)胞。許多研究表明，T細(xì)胞功能異常，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(IL-4，IL-13等)在FSGS和MCD病變的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS病人血清白細(xì)胞介素13(IL-13)水平較正常人升高。因此，IL-13對(duì)足細(xì)胞的直接作用可能是FSGS的發(fā)病機(jī)制之一。本研究檢測(cè)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞上IL-13受體的表達(dá)，觀察IL-13對(duì)足細(xì)胞的直

2、接損傷作用，并初步探討了其作用機(jī)制。 目前，F(xiàn)SGS的治療首選藥物依然是糖皮質(zhì)激素，但其完全緩解率尚不足30％。而在治療中力求使蛋白尿在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到緩解可明顯改善患者的預(yù)后。雷公藤甲素用于腎小球疾病的治療已有30多年的歷史，在FSGS的治療中有著積極的意義。前期的研究也發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對(duì)嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PA)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷存在保護(hù)作用。既然IL-13誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷是FSGS可能的發(fā)

3、病機(jī)制之一，因此，我們繼續(xù)探討了雷公藤甲素在體外IL-13誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用。 本研究由兩部分組成 第一部分：IL-13誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制的研究 目的： 足細(xì)胞是MCD和FSGS腎組織病變形成的主要受損靶細(xì)胞。許多研究表明，T細(xì)胞功能異常，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(IL-4，IL-13等)在FSGS和MCD病變的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。為探討Th2細(xì)胞因子IL-13是否直接介導(dǎo)足細(xì)胞損

4、傷，我們使用溫度敏感的小鼠足細(xì)胞系(heat sensitive mouse podocyte，HSMP)，檢測(cè)足細(xì)胞上IL-13受體的表達(dá)，觀察IL-13對(duì)足細(xì)胞的直接損傷作用，并初步探討了其作用機(jī)制。 方法： RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)HSMP上IL-13受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。使用不同濃度(10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml)的IL-13干預(yù)足細(xì)胞不同時(shí)間(8h，12h，24h)，免疫熒光法

5、分析足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin和細(xì)胞間連接蛋白ZO-1的變化情況。并進(jìn)一步應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路STAT6的磷酸化水平，探討IL-13損傷足細(xì)胞的作用機(jī)制。 結(jié)果： HSMP上存在IL-13Ⅰ型受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。骨架蛋白F-actin和ZO-1的染色結(jié)果顯示：IL-13可呈劑量和時(shí)間依賴性對(duì)足細(xì)胞造成損傷。50ng/ml IL-13作用24小時(shí)即可造成足細(xì)胞明顯損傷。F-ac

6、tin變細(xì)、紊亂，向細(xì)胞邊緣聚集：ZO-1明顯減弱和斷裂。進(jìn)一步的研究還表明，IL-13可誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子相關(guān)的STAT6信號(hào)通路的活化。STAT6信號(hào)通路特異性抑制劑leflunomide可阻斷IL-13對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間連接蛋白的影響。 結(jié)論： 足細(xì)胞表面存在IL-13受體，IL-13可通過(guò)與其受體結(jié)合損傷足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間連接蛋白。IL-13對(duì)足細(xì)胞的損傷作用與STAT6信號(hào)通路的活化有關(guān)。

7、 第二部分：雷公藤甲素干預(yù)IL-13誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用研究 目的： 目前，F(xiàn)SGS的治療首選藥物依然是糖皮質(zhì)激素，但其完全緩解率尚不足30％。。雷公藤甲素用于腎小球疾病的治療已有30多年的歷史，在FSGS的治療中有著積極的意義，小劑量激素聯(lián)合雷公藤甲素可明顯提高完全緩解率和縮短完全緩解時(shí)間。前期的研究也發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對(duì)嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PA)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷存在保護(hù)作用

8、。研究-提示IL-13介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷可能是FSGS發(fā)病的相關(guān)機(jī)制之一。本研究使用HSMPs，用IL-13誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型，觀察雷公藤甲素對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。 方法： 使用不同濃度(1ng/ml，3ng/ml，10ng/ml)的雷公藤甲素預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后，加入IL-13(50ng/ml)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，免疫熒光法分析足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin和細(xì)胞間連接蛋白ZO-1的變化情況。并進(jìn)一步應(yīng)

9、用Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路STAT6的磷酸化水平，探討雷公藤甲素干預(yù)IL-13誘導(dǎo)足細(xì)胞作用的機(jī)制。選用地塞米松(1μM)作為藥物對(duì)照。 結(jié)果： 雷公藤甲素對(duì)IL-13誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，其作用與地塞米松相似。骨架蛋白F-actin的染色結(jié)果顯示：3ng/ml及10ng/ml的雷公藤甲素可明顯阻斷IL-13誘導(dǎo)的F-actin的損傷，F(xiàn)-actin的表達(dá)得以部分恢復(fù)，細(xì)胞骨架重

10、排；1μM的地塞米松可使細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，骨架重排。ZO-1的染色結(jié)果顯示：3ng/ml及10ng/ml的雷公藤甲素可明顯阻斷IL-13誘導(dǎo)的ZO-1的損傷，ZO-1表達(dá)增強(qiáng)，連續(xù)性得以恢復(fù)；1μM的地塞米松可阻斷IL-13誘導(dǎo)的ZO-1損傷，ZO-1的表達(dá)和排列基本恢復(fù)正常。進(jìn)一步的研究還表明，雷公藤甲素和地塞米松均可抑制IL-13誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子相關(guān)的STAT6信號(hào)通路的活化，其中地塞米松的效果更強(qiáng)。 結(jié)論：