白細(xì)胞介素18(IL-18)調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是機(jī)體的重要器官，具有極強(qiáng)的再生能力。肝再生（liver regeneration, LR）過(guò)程受機(jī)體的精密調(diào)控，包括細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多種功能蛋白參與，涉及多條信號(hào)通路的交互作用。白細(xì)胞介素18（interleukin18, IL-18）是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子，除具較強(qiáng)的γ-干擾素誘生能力外，還可增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性，刺激T細(xì)胞、成骨、生殖細(xì)胞等細(xì)胞增殖，刺激產(chǎn)生粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附因子等。然而，迄今為止，IL

2、-18對(duì)肝細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、庞蒙锔咄繖z測(cè)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)IL-18在大鼠肝再生中對(duì)肝細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了理論分析和功能預(yù)測(cè)。首先，根據(jù)GenMAPP、KEGG、QIAGEN等網(wǎng)站資料查找IL-18通路網(wǎng)絡(luò)圖并匯總通路相關(guān)基因。其次，根據(jù)TRED、Lymph TF-DB等網(wǎng)站資料查找通路中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的靶基因，這些靶基因再經(jīng)NCBI網(wǎng)站上“Gene Ont

3、ology”篩選得到與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因。然后，制備大鼠2/3肝切除模型（partial hepatectomy, PH），分離再生肝的肝細(xì)胞，用Rat Genome2302.0芯片檢測(cè)上述基因在大鼠肝再生中的表達(dá)變化。最后，用譜函數(shù)Ep(t)分析它們的協(xié)同作用預(yù)示的生理活動(dòng)。結(jié)果表明，IL-18信號(hào)通路包括NF-κB、p38/ATF2、JNK3條途徑，涉及33個(gè)通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的395個(gè)靶基因。其中，13個(gè)通路相關(guān)基因和49

4、個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因在大鼠肝再生中發(fā)生有意義的表達(dá)變化。此外，IL-18信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)與該通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖活動(dòng)（Ep(t)值）于PH后12-72h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。其中，NF-κB途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的基因協(xié)同值分別于PH后2-36h和6-72h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；p38/ATF2途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)分別于2h、24-120h和2-72h顯著高于對(duì)照組

5、（P＜0.05）；JNK途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)分別于2h、12-72h和6-24h、72h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。這些研究結(jié)果表明，IL-18可能通過(guò)NF-κB、p38/ATF2和JNK途徑在大鼠肝再生的啟動(dòng)和進(jìn)展階段促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。
　?、蒲芯苛薎L-18對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A的增殖調(diào)節(jié)作用。首先，用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞周期中IL-18的表達(dá)

6、變化。其次，通過(guò)重組大鼠IL-18蛋白（recombinant rat IL-18, rrIL-18）和小干擾 RNA（shortinterference RNA, siRNA）處理細(xì)胞，MTT和BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。最后，用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)IL-18通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，同步化的BRL-3A細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期后3.3

7、h（G0/G1）和8.6h（G1/S）時(shí)，IL-18的mRNA和蛋白水平顯著升高。用 siRNA干涉 IL-18表達(dá)后48h，細(xì)胞活力明顯低于陰性對(duì)照組（negative control, NC）（P＜0.05），G2/M期的細(xì)胞比率也低于NC組。此外，5-10ng/ml的rrIL-18處理細(xì)胞后24h和48h，細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比率也明顯升高（P＜0.05）。qRT-PCR和West

8、ern blot結(jié)果顯示，NF-κB途徑上游的募集蛋白MyD88、NF-κB及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1、cyclin B2均顯著高于對(duì)照組；p38/ATF2途徑的轉(zhuǎn)錄因子ATF2及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表達(dá)上調(diào)，用siRNA干涉BRL-3A細(xì)胞的IL-18表達(dá)，這些基因和蛋白的表達(dá)水平也隨之降低。因此，我們推測(cè) IL-18通過(guò) NF-κB和 p38/ATF2途徑，進(jìn)一步激活與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因CCNB1

9、、CCNB2、CCNA2和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)節(jié)BRL-3A大鼠肝細(xì)胞增殖。
　　⑶用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)大鼠肝再生中IL-18在再生肝中的表達(dá)變化，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)大鼠肝再生中IL-18在下腔靜脈血漿中的含量變化。其次，將rrIL-18通過(guò)尾靜脈注入PH大鼠體內(nèi)，用BrdU免疫熒光法檢測(cè)再生肝的細(xì)胞增

10、殖情況，然后，用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)IL-18通路相關(guān)基因及受通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，IL-18的mRNA于PH后2h和36h顯著升高（P＜0.05），12h和72h恢復(fù)至正常水平。同時(shí)，下腔靜脈血漿中IL-18含量也于PH后2h開(kāi)始升高，12h和48h兩次達(dá)到高峰（P＜0.05）。此外，大鼠PH后立即注射rrIL-18，24h時(shí)檢測(cè)再生肝的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果表明4μg/只注射劑

11、量組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明， rrIL-18處理PH大鼠后24h，再生肝中的募集蛋白MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；p38/ATF2途徑調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表達(dá)上調(diào)，這些研究結(jié)果與其調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞增殖的機(jī)制相一致。以上結(jié)果表明，大鼠肝再生中IL-18