山羊白細胞介素-4和白細胞介素-18基因的克隆、表達及生物學(xué)活性分析.pdf

1、細胞因子是在抗原遞呈細胞（APCs）、淋巴細胞和其它宿主細胞間發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一類高活性多功能的蛋白質(zhì)多肽分子。白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素-18（IL-18）在介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)、細胞免疫反應(yīng)、抵抗微生物感染和抗腫瘤方面均起著非常重要的作用。
　　 根據(jù)GenBank中發(fā)表的山羊IL-4和IL-18基因序列，設(shè)計特異性引物，應(yīng)用RT-PCR方法擴增出了山羊IL-4和IL-18的全序列（pGIL-4，pGIL-18），將二者

2、克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切分析、序列測定鑒定及序列分析，克隆得到的pGIL-4基因的開放閱讀框含有408個核甘酸，編碼135個氨基酸，包含24個氨基酸的信號肽。PGIL-18全基因有582個堿基，編碼193個氨基酸，前36個氨基酸殘基為前導(dǎo)肽。通過CLUSTALX和MEGA4.0軟件繪制了多種哺乳動物IL-4和IL-18的氨基酸進化樹。
　　 自pMD-pGIL-4和pMD-pGIL-18中分別擴增其成熟蛋白（mIL-4

3、和mGIL-18）基因，并將其亞克隆至原核表達載體pET-32a（+）和pET-28a（+）中，構(gòu)建了pET-32a（+）-mGIL-4和pET-28a（+）-mGIL-18原核表達載體，然后分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中進行誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所得到重組蛋白分別約為31.3KDa和22.3KDa。將這兩個重組蛋白經(jīng)超聲波裂解，主要包涵體形式表達。
　　 利用MTT法檢測山羊重組白介素-4（rm

4、GIL-4）對山羊外周血T淋巴母細胞的增殖活性，發(fā)現(xiàn)rmGIL-4能顯著刺激山羊外周血T淋巴母細胞的增殖，并在一定劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在8μg/ml時對T淋巴母細胞的刺激效應(yīng)最強。為了檢測山羊重組白介素-18（rmGIL-18）在體外促進小鼠腹腔巨噬細胞和分泌NO的效應(yīng)，本實驗檢測了小鼠腹腔巨噬細胞對中性紅的吞噬能力，并測定了rmGIL-18作用于巨噬細胞后細胞培養(yǎng)液中NO的濃度，結(jié)果顯示rmGIL-18對小鼠腹腔巨噬細胞的