轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)白細(xì)胞介素-21的研究.pdf

1、[目的]： 1.白細(xì)胞介素21(IL-21)是一類新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，具有多種生物功能，包括對(duì)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的調(diào)控，免疫保護(hù)，抗腫瘤作用，調(diào)控骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等。近年來(lái)，利用乳腺生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的熱點(diǎn)。本研究構(gòu)建了一類含人IL-21(hIL-21)基因的隨機(jī)整合載體，通過(guò)體細(xì)胞克隆把整合有hIL-21基因的胚胎移植到山羊子宮，希望能在該胚胎發(fā)育來(lái)的轉(zhuǎn)基因山羊乳腺中表達(dá)hIL-21蛋白，從而為大規(guī)

2、模生產(chǎn)hIL-21奠定基礎(chǔ)。 2.β-酪蛋白位點(diǎn)的基因打靶效率十分低下，成功進(jìn)行了基因打靶的研究還未有報(bào)道。為了探尋一種能夠提高打靶效率的方法，我們利用構(gòu)建好的山羊β-酪蛋白位點(diǎn)hIL-21基因打靶載體，在細(xì)胞周期同步于S期的山羊胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，希望獲得一種能提高基因打靶效率的方法。 [方法]: 1.從健康人體外周靜脈取靜脈血利用苯酚/氯仿方法提取基因組DNA，以此基因組DNA為模板，通過(guò)分段擴(kuò)增的方

3、法擴(kuò)增編碼hIL-21基因組編碼區(qū)序列。 2.從健康人體外周靜脈取靜脈血通過(guò)Ficoll密度梯度離心法分離得到淋巴細(xì)胞后，加入PMA、ConA、PHA，于37℃培養(yǎng)48hr以激活淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增hIL-21cDNA全長(zhǎng)序列。 3.利用所得到的hIL-21全長(zhǎng)基因組編碼區(qū)序列構(gòu)建一種山羊β-乳球蛋白(BLG)調(diào)控的隨機(jī)表達(dá)載體，hIL-21cDNA全長(zhǎng)序列經(jīng)克隆重組構(gòu)建一種β-酪蛋白調(diào)控的隨

4、機(jī)表達(dá)載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法把兩種隨機(jī)表達(dá)載體導(dǎo)入山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，G418抗性篩選后用PCR和Southernblot檢測(cè)鑒定陽(yáng)性細(xì)胞克隆。 4.以所獲得的一株陽(yáng)性細(xì)胞作為核供體，使用體細(xì)胞核移植的方法獲得重構(gòu)囊胚，移植到假孕母羊子宮中待其妊娠，并對(duì)流產(chǎn)胎兒進(jìn)行整合情況的檢測(cè)。 5.通過(guò)胸腺嘧啶核苷阻斷方法使大量細(xì)胞同步在S期，然后將構(gòu)建在山羊β-酪蛋白基因位點(diǎn)的hIL-21打靶載體轉(zhuǎn)染已同步化的細(xì)胞，

5、對(duì)G418抗性細(xì)胞用PCR的方法檢測(cè)其基因打靶效率的變化。 [結(jié)果]: 1.使用分段擴(kuò)增的方法擴(kuò)增出了hIL-21基因組編碼區(qū)4kb和4.8kb的上、下游片段。所獲的hIL-21基因組編碼區(qū)上、下游片段連接后獲得全長(zhǎng)8.3kb的hIL-21基因組編碼區(qū)DNA，并構(gòu)建出含hIL-21基因組編碼區(qū)DNA的隨機(jī)整合表達(dá)載體(pBLG-IL21G)。 2.使用PMA、ConA、PHA聯(lián)用的方法激活了淋巴細(xì)胞表達(dá)hIL-2

6、1，從激活后的淋巴細(xì)胞中提取了RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出了hIL-21cDNA，然后構(gòu)建出含hIL-21cDNA的隨機(jī)整合載體(pBC1-IL21C)。 3.兩種質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染后用G418進(jìn)行篩選，挑取抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR陽(yáng)性細(xì)胞再繼續(xù)進(jìn)行Southernblot鑒定，獲得1株pBLG-IL21G轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞和6株pBC1-IL21C轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。 4.一株陽(yáng)性細(xì)胞作為核供體細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植，共有55

7、個(gè)發(fā)育良好的重構(gòu)囊胚移植到21只假孕母羊的子宮內(nèi)，移植后35d用超聲檢測(cè)到4只母羊懷孕，4只母羊分別于妊娠48d，52d，70d，108d時(shí)流產(chǎn)，僅收集到妊娠108d的1只流產(chǎn)胎兒，經(jīng)外源基因的檢測(cè)結(jié)果表明該流產(chǎn)胎兒的基因組中整合了目標(biāo)基因。 5.用打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期已同步化在S期的細(xì)胞，兩次轉(zhuǎn)染共獲得抗性細(xì)胞克隆560個(gè)，對(duì)這些克隆進(jìn)行了同源重組位點(diǎn)的PCR檢測(cè)，均未能擴(kuò)增出特異的條帶。 [結(jié)論]： 1.構(gòu)建

8、了一種插入了hIL-21基因組編碼區(qū)DNA的由山羊β-乳球蛋白調(diào)控的隨機(jī)整合表達(dá)載體和一種插入了hIL-21cDNA的由山羊β-酪蛋白調(diào)控的隨機(jī)整合表達(dá)載體。 2.構(gòu)建了插入了hIL-21基因組編碼區(qū)DNA和插入了hIL-21cDNA的山羊β-酪蛋白基因位點(diǎn)打靶載體。 3.獲得了1株整合有pBLG-IL21G的山羊胚胎成纖維細(xì)胞和6株整合有pBC1-IL21C的山羊胚胎成纖維細(xì)胞。 4.分段擴(kuò)增長(zhǎng)片段hIL-21