豬白細(xì)胞介素2（pIL-2）與豬白細(xì)胞介素6（pIL-6）的基因表達(dá)及作為疫苗佐劑的研究.pdf

1、由病毒、細(xì)菌等病原微生物侵染動(dòng)物所引起的各種傳染性疾病嚴(yán)重制約了各個(gè)國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)也對(duì)人類健康存在著巨大隱患。因此，對(duì)動(dòng)物傳染性疾病的防治措施研究具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。疫苗免疫是當(dāng)前預(yù)防和控制傳染性疾病的主要措施，但目前使用的常規(guī)疫苗并不理想，存在免疫效率低與安全性差的兩大難題。因此，如何在安全劑量疫苗接種下提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，成為當(dāng)今世界疫苗開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。 細(xì)胞因子是由免疫效應(yīng)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)

2、生的，具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白。它在免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中具有重要作用，可作為新一代免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果。二十多年來(lái)，各國(guó)學(xué)者致力于細(xì)胞因子重組蛋白作為疫苗佐劑研究，取得了許多振奮人心的結(jié)果：多種細(xì)胞因子重組蛋白包括IL、IFN、TNF、GM-CSF等，均能在不同程度上增加常規(guī)疫苗，包括滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗等的免疫效應(yīng)。近年來(lái)，將細(xì)胞因子基因作為DNA疫苗佐劑，由于其簡(jiǎn)便性與有效性，亦受到了人們愈來(lái)愈多的關(guān)注與重視。

3、 鑒于此，本研究以豬白細(xì)胞介素2(pIL-2)與豬白細(xì)胞介素6(pIL-6)為研究對(duì)象，開(kāi)展了這兩種細(xì)胞因子以及他們的融合蛋白(pIL6-IL2)以重組蛋白的形式對(duì)常規(guī)疫苗PRV滅活疫苗的佐劑效應(yīng)研究，及以基因形式對(duì)PRRSVORF5核酸疫苗的佐劑效應(yīng)研究。主要研究?jī)?nèi)容包括： 1.pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2的原核表達(dá)及純化構(gòu)建pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2原核表達(dá)載體，均在E.coliBL21(D

4、E3)中獲得高效表達(dá)。其中rpIL-2包含信號(hào)肽序列，rpIL-6不含信號(hào)肽序列，rpIL6-IL2由一段親水性、低電荷效應(yīng)的Linker連接均不含信號(hào)肽的pIL-6與pIL-2分子組成。三種原核表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式產(chǎn)生，因此通過(guò)提取包涵體—SKL變性—透析復(fù)性的生化提純步驟來(lái)獲取有生物學(xué)活性的重組蛋白。另將提純了的原核表達(dá)產(chǎn)物rpIL-2、rpIL-6免疫家兔制備多克隆抗體。 2.pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2的酵

5、母表達(dá)及純化構(gòu)建pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2酵母表達(dá)載體，在P.pastorisGS115菌株獲得分泌型表達(dá)。對(duì)3種酵母表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行了Westernblot檢測(cè)，驗(yàn)證為目的蛋白。通過(guò)N端糖基化分析，發(fā)現(xiàn)酵母表達(dá)產(chǎn)物rpIL-2帶有約5kDa的N端糖鏈，rpIL-6無(wú)N端糖基化修飾，rpIL6-IL2則以有糖鏈、無(wú)糖鏈兩種分子狀態(tài)存在，之間相差約2kDa；采用硫酸銨沉淀—PBS鹽析一PEG20000濃縮的純化辦法，除去培養(yǎng)

6、基中的毒性成分。對(duì)3種重組酵母菌進(jìn)行了分泌外源蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間及菌株持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)情況分析，驗(yàn)證誘導(dǎo)培養(yǎng)第4、5天外源蛋白分泌量最高；只需保持一定的酵母生長(zhǎng)濃度，重組酵母菌可持續(xù)培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。提純的酵母表達(dá)產(chǎn)物凍干活性相對(duì)穩(wěn)定，在4℃可放置4個(gè)月以上。 3.兩種體系表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定及比較利用IL-2依賴的CTLL-2細(xì)胞株，IL-6依賴的B9細(xì)胞株增殖試驗(yàn)分別檢測(cè)了3種細(xì)胞因子原核表達(dá)產(chǎn)物及酵母表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活

7、性。結(jié)果顯示兩種體系的表達(dá)產(chǎn)物均有生物學(xué)活性，而酵母表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性要遠(yuǎn)高于原核表達(dá)產(chǎn)物，活性單位相差1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。遂選用3種酵母表達(dá)產(chǎn)物作為候選疫苗佐劑進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)。 4.開(kāi)展本動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞因子重組蛋白對(duì)PRV滅活苗的佐劑效應(yīng)研究PRV滅活苗免疫1次(2mL/頭份)，輔以純化的候選疫苗佐劑接種3次(1×105U/頭份)，8周后攻毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rpIL-2對(duì)PRV滅活苗具有很好的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。不管是在免疫應(yīng)答方面(

8、包括體液免疫與細(xì)胞免疫)，還是在病毒攻擊后對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的免疫保護(hù)力方面，PRV+IL2試驗(yàn)組均顯著高于PRV+PBS對(duì)照組。rpIL-6與rpIL6-IL2則對(duì)PRV滅活苗未表現(xiàn)出明顯的佐劑效應(yīng)。 5.連有細(xì)胞因子基因的PRRSVORF5核酸疫苗構(gòu)建分別構(gòu)建4種帶雙順?lè)醋拥恼婧吮磉_(dá)質(zhì)粒：pCI-ORF5-neo、pCI-ORF5-IL2、pCI-ORF5-IL6與pCI-ORF5-IL6-IL2，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。CTLL-2與B

9、9細(xì)胞增殖試驗(yàn)確證3種質(zhì)粒中的細(xì)胞因子均獲得分泌性表達(dá)。 6.開(kāi)展小鼠動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞因子基因?qū)RRSVORF5核酸疫苗的佐劑效應(yīng)研究BALB/c小鼠免疫兩次，分別于第4、6、8周采血檢測(cè)小鼠的中和抗體水平與ELISA抗體水平。結(jié)果顯示這3種細(xì)胞因子基因在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面，對(duì)PRRSVORF5核酸疫苗均有免疫增強(qiáng)效應(yīng)。 本研究通過(guò)開(kāi)展豬細(xì)胞因子蛋白對(duì)PRV滅活苗疫苗的佐劑效應(yīng)研究，以期獲得一種效果顯著且又提取簡(jiǎn)便，