大豆異黃酮Genistein對卵巢癌細(xì)胞作用的體外研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科惡性腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。 卵巢癌早期無癥狀，患者就診時常為盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移，雖然目前有鉑類等化療藥物可用于治療卵巢癌，但5年總生存率只有35％-40％。如何應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段，提高卵巢癌的治療效果，仍是婦科腫瘤工作者肩負(fù)的重任。另外，卵巢癌患者常常需行手術(shù)切除卵巢，年輕患者常常詢問能否補(bǔ)充雌激素以改善因

2、雌激素減少而導(dǎo)致的不適。但以往的研究發(fā)現(xiàn)：雌激素對卵巢癌細(xì)胞株有促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移的作用。因此，常常告訴患者盡量不用雌激素替代治療。 異黃酮(Genistein)又名4，5，7-三羥基異黃酮，是大豆異黃酮的一種，是植物雌激素中最重要的也是生物活性最強(qiáng)的一種。近年來，許多研究表明，大豆異黃酮具有抗氧化、抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、預(yù)防心血管疾病、改善婦女更年期障礙、抗衰老等諸多生理功能。在婦科方面，大量的體內(nèi)及體外實驗已表明大豆異黃酮類物質(zhì)

3、對雌激素受體陽性的多種癌細(xì)胞(乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等)生長有明顯的抑制作用。 目前認(rèn)為，Genistein通過與17 β-雌二醇競爭結(jié)合受體來發(fā)揮弱雌激素樣作用，同時，還與雌二醇競爭性結(jié)合ER，表現(xiàn)出雌激素拮抗作用，從而對腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，因此對一系列的激素依賴性疾病發(fā)揮預(yù)防和治療性作用。直到20世紀(jì)90年代，國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者經(jīng)流行病學(xué)、免疫學(xué)、動物體內(nèi)等系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，長期食用大豆食品的東南亞人群中，其癌癥、心血管系統(tǒng)疾

4、病的發(fā)生率明顯低于西方。此外，許多體內(nèi)和體外實驗研究表明，Genistein能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤血管新生和蛋白酪氨酸激酶活性，而對造血細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞等正常組織細(xì)胞無明顯的毒副作用。 有關(guān)異黃酮與卵巢癌關(guān)系的研究，曾有流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)服用大豆異黃酮的量與卵巢癌的發(fā)病有明顯負(fù)相關(guān)的關(guān)系。另有作者發(fā)現(xiàn)Genistein對卵巢癌細(xì)胞的生長有抑制作用。但是Genistein究竟是弱雌激素樣作用還是抗雌

5、激素作用，對卵巢癌細(xì)胞生長的作用是抑制還是促進(jìn)，目前尚無定論。 本研究應(yīng)用人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV<,3>為研究對象就Genistein對卵巢癌細(xì)胞株的作用進(jìn)行體外研究，了解不同濃度的Genistein作用不同時間對該細(xì)胞增殖的影響。進(jìn)一步了解用藥后腫瘤細(xì)胞凋亡的情況，及雌激素受體亞型ER-β的表達(dá)情況，并通過Genistein與化療藥物順鉑合用，以了解異黃酮聯(lián)合順鉑后對卵巢癌細(xì)胞株的治療作用及雌激素受體B亞型的改

6、變。通過本研究初步了解Genistein對卵巢癌細(xì)胞株的作用，為其應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。 第一部分Genistein對卵巢癌細(xì)胞株SKOV<,3>增殖與凋亡的影響 目的:了解Genistein對卵巢癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響，并與17 β雌二醇(E<,2>)的作用相比較。 方法:采用集落形成實驗和MTT比色法檢測不同濃度的Genistein經(jīng)過不同時間對SKOV<,3>細(xì)胞的作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測S

7、KOV<,3>細(xì)胞經(jīng)不同濃度Genistein處理24h和48h的凋亡作用。 結(jié)果:與對照組相比，5、10、20、40、80 μmol/L Genistein作用24h、48h，對SKOV<,3>細(xì)胞的抑制率分別為13.04％、36.69％、38.70％、45.91％、87.49％及24.05％、38.51％、50.81％、62.05％、77.18％(P<0.01)；相反，當(dāng)E<,2>用藥濃度為10<'-10>μmol/L時，2

8、4h、48h和72h對細(xì)胞的抑制率分別為-1.35％、-1.93％、-0.15％，與對照組相比有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。取對數(shù)生長期的SKOV。單細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng)，加入Genistein 10、20、40 μmol/L，集落抑制率分別為16.36％、21.82％、48.76％，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。小劑量Genistein(5、μmol/L)僅能引起SKOV<,3>細(xì)胞發(fā)生輕微凋亡(4.24％、14.08％)，而20、40 μmol/L Geni

9、stein均能誘導(dǎo)大量SKOV<,3>細(xì)胞發(fā)生凋亡(97.46％、86.16％)。 第二部分Genistein與順鉑聯(lián)用對卵巢癌細(xì)胞株SKOV<,3>凋亡作用 目的:探討Genistein與順鉑聯(lián)用對卵巢癌細(xì)胞株SKOV<,3>凋亡作用。 方法:采用MTT法檢測Genistein單用及與順鉑聯(lián)合對細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀分析Genistein及聯(lián)合順鉑對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果:與對照組相比，0

10、.75、1.5 μmol/L順鉑對細(xì)胞作用48h，抑制率分別為14.89％、31.21％，聯(lián)用Genistein(5、10、20 μmol/L)顯著增強(qiáng)抑制效果，與0.75 μmol/LDDP聯(lián)合作用24h、48h的抑制率分別為13.4％、6.5％、47.99％和51.59％、56.15％、67.68％；1.5 μmol/LDDP聯(lián)合作用24h、48h的抑制率分別為61.31％、66.57％、66.69％和63.1％、71.21％、78

11、.56％，比順鉑單藥作用效果顯著，統(tǒng)計學(xué)檢驗有意義。 流式細(xì)胞檢測，順鉑0.75、1.5μmol/L作用48h后，SKOV<,3>細(xì)胞發(fā)生早期凋亡率為8.87％、5.23％。與順鉑單藥相比，聯(lián)合10、20μmol/LGenistein則引起大量細(xì)胞發(fā)生凋亡(86.43％、92.09％和39.88％、51.06％)。與對照組(6.36±5.2654)比較，10、20 μmol/L Genistein作用與SKOV<,3>細(xì)胞48h

12、后G0-G1期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞周期阻滯在G2-M期(14.16±0.4423，62.42±4.4859)。聯(lián)用順鉑與0.75μmol/L順鉑單藥(37.96±3.2752)相比，10μmol/L Genistein則使大部分細(xì)胞阻滯于S期(88.83±0.4598)，20 μmol/L Genistein使細(xì)胞G2-M期阻滯(40.58±0.6018)。 第三部分Genistein作用于卵巢癌細(xì)胞株SKOV<,3>后ER-β的

13、表達(dá)改變。 目的:了解異黃酮和17 β雌二醇(E<,2>)分別作用與卵巢癌細(xì)胞后雌激素受體亞型β(ER-β)的表達(dá)情況。 方法:應(yīng)用Western Blot印跡分析方法檢測不同濃度Genistein和E<,2>作用SKOV<,3>細(xì)胞后ER-β蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果:WesternBlot檢測出ER-β條帶，隨著Genistein用藥濃度的增加(5、10、20 μmol/L)作用48h，條帶的表達(dá)增強(qiáng)，條帶積分光度

14、(ID)值分別為(0.65±0.0666、2.01±0.0643、2.33±0.0874)，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；與E<,2>比較，Genistein用藥組ER-β條帶表達(dá)較高。 結(jié)論: 1.Genistein能抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，且具有時間、劑量效應(yīng)關(guān)系；相反，17 β雌二醇(E<,2>)對卵巢癌細(xì)胞抑制影響很小，小劑量E<,2>還能促進(jìn)細(xì)胞增殖。 2.Genistein能夠增強(qiáng)SKOV<,3>該細(xì)胞對順鉑的敏感性