轉(zhuǎn)導(dǎo)HER2基因啟動(dòng)子控制的HSV-TK基因?qū)β殉舶┘?xì)胞特異性殺傷作用的研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)導(dǎo)HER2基因啟動(dòng)子控制的HSVTK基因?qū)β殉舶┘?xì)胞特異性殺傷作用的研究姓名：鄭姝穎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：孫開來2000.3.1(HSVITK基因，又稱自殺基因，其產(chǎn)物本身沒有殺傷細(xì)胞的功能，但是在加入同樣無毒性的藥物前體GCV或ACV后，HSV—TK可在細(xì)胞內(nèi)特異地催化GCV或ACV的磷酸化反應(yīng)，生成單核苷酸類似物，后者經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的TK進(jìn)一步催化進(jìn)行二磷酸化和三磷酸化。三磷酸化的GCV

2、可抑制DNA聚合酶活性，終止DNA鏈的延長(zhǎng)，殺死腫瘤細(xì)胞另外TK基因的旁觀者效應(yīng)在一定程度上彌補(bǔ)了當(dāng)前基因轉(zhuǎn)移效率低的不足：不但表達(dá)TK基因的細(xì)胞可被殺死，其周圍沒有表達(dá)TK的腫瘤細(xì)胞也可因細(xì)胞間縫隙連接的交流，胞吞作用或免疫反應(yīng)而被殺傷。；二GFP(綠色熒光蛋白)是在水母體內(nèi)存在的一種能在長(zhǎng)波紫外光或藍(lán)光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。本研究中使用的突變型GFP是在生色基團(tuán)處的65位氨基酸進(jìn)行改造的S65TGFP。它在普通日光照射下即可

3、發(fā)出綠色熒光，無須任何底物和化學(xué)反應(yīng)，是一種使用非常方便的報(bào)告基因[21I。先以S65TGFP與HER2啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，如果HER2啟動(dòng)子可在HER2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系中控制GFP特異性表達(dá)，再進(jìn)行TK基因治療的試驗(yàn)，以保證工作的可行性。材料和方法：質(zhì)粒：PuHER2、PH8V106、P865TGFP、PLxSN。細(xì)胞系：PT67、NIH3T3、SKOV一3、MCF7。菌株：DH5Q工具酶：T4連接酶、牛腸堿性磷酸酶、限制性內(nèi)切酶

4、、AlkPhosDirect堿磷酶標(biāo)記試劑盒。其它生化試劑：Fugene6、DMEM、G418、Trizol、GCV、Zeta—Probe陽離子尼龍膜。1PCR法獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的HER2基因啟動(dòng)子片段。設(shè)計(jì)引物時(shí)在特異性序列5’端分別加上EcoRI和BamHI識(shí)別序列。擴(kuò)增條件：94。C，5min一(94。C，lmin一57。C。linin972。Clmin)X3572。C，10min2PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamⅡ酶切后與同樣