IL-18基因聯(lián)合HSV-TK基因?qū)6鼠膠質(zhì)瘤殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的一種腫瘤,它具有惡性級別進(jìn)行性升高、高度浸潤性的特點(diǎn)。盡管神經(jīng)外科技術(shù)、放射治療及化學(xué)治療水平不斷提高,但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及間變性星形細(xì)胞瘤預(yù)后仍很差,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人自診斷后平均生存時(shí)間不超過1年,5年生存率不足5％。因此,尋找一種理想的輔助性治療手段勢在必行。
　　 廣為應(yīng)用的自殺基因(suicide genes)治療又稱為病毒介導(dǎo)的酶前藥療法(viru directedenzymepro

2、drug therapy,VDEPT),它是將自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞而將無毒性前體藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝為毒性產(chǎn)物,通過抑制DNA合成進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫因子是細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,能明顯增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,從而產(chǎn)生并增強(qiáng)全身抗腫瘤的免疫反應(yīng)。把兩種途徑相結(jié)合并同時(shí)作用,可最大限度地提高殺滅腫瘤的效力。盡管膠質(zhì)瘤的HSV-TK/GCV治療在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中療效顯著,但臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)結(jié)果不能令人滿意。所以探索旨在提高HSV-TK療效的優(yōu)化治療

3、方案具有必要性。本研究目的在于探討腺病毒載體介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)與免疫因子白細(xì)胞介素-18(IL-18)聯(lián)合應(yīng)用對C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用,希望能夠?yàn)榻窈笤撃[瘤基因治療的臨床研究和應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　 方法:1.復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建:通過DNA重組技術(shù),構(gòu)建含有目的基因的復(fù)制缺陷型腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18。2.PcR檢測目的基因表達(dá):

4、將上述重組腺病毒液感染293細(xì)胞,提取DNA,進(jìn)行PCR鑒定。3.目的基因表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定:分別提取C6/TK及C6/IL-18總蛋白,行表達(dá)蛋白的固定及分析。4.重組腺病毒滴度測定:氯化銫密度梯度超速離心法純化,OD260法測定病毒滴度。5.腺病毒轉(zhuǎn)染效率的測定:C6細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞密度4×104個(gè)/ml,用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1、10、50、100、200的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)重組腺病毒感染C6

5、細(xì)胞,37℃孵育48h,顯微鏡觀察,綠色熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析感染效率。6.細(xì)胞殺傷作用觀察:C6細(xì)胞、轉(zhuǎn)染的C6-TK及C6-IL-18細(xì)胞以每孔4×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板,每板分組如下:1)對照組(C6):2)HSV-TK/GcV組;3)IL-18組;4)TK與IL-18聯(lián)合組,每組設(shè)4個(gè)平行孔,24小時(shí)后加入GCV(10ug/ml),1、3、5天MTT法進(jìn)行檢測并計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率。7.旁觀者效應(yīng)觀察:將感染未感

6、染的細(xì)胞以不同比例混合接種于96孔培養(yǎng)板中(4×103個(gè)細(xì)胞/孔),24小時(shí)后加入GcV(10ug/ml),培養(yǎng)5天,MTT法檢測計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率。8.體內(nèi)試驗(yàn):(1)立體定向動(dòng)物模型的建立:立體定向接種5×105個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞于雄性SD大鼠右尾狀核頭部。(2)動(dòng)物分組,每組10只大鼠:①對照組:僅顱內(nèi)接種C6細(xì)胞。②TK/GCV治療組:第5天原位多點(diǎn)注入AdCMV-TK40ul,第7天,GCV 30mg.kg-1 day-1×14

7、d,腹腔注射。③IL-18治療組:第5天原位多點(diǎn)注)kAdCMV-IL-18 40 ul。④IL-18/TK-GCV聯(lián)合治療組:第5天原位多點(diǎn)注入AdCMV-IL-18 40 ul,第6天注入AdCMV-TK 40 ul,第7天,GCV 30mg.kg-1 day-1×14d,腹腔注射。于1、2、6周隨機(jī)強(qiáng)化MRI動(dòng)態(tài)觀察3只鼠顱內(nèi)腫瘤生長情況;并于注射病毒后2天,對照組處死2只大鼠,各治療組處死4只大鼠,取注射部位腫瘤組織,行實(shí)時(shí)定量

8、PCR檢測目的基因TK及IL-18的表達(dá)。9.免疫組化分析:8周后結(jié)束試驗(yàn),處死剩余全部動(dòng)物,連同之前自然死亡大鼠,取大鼠腫瘤組織。1096福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色;對CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤情況,采用ABC法進(jìn)行免疫組化檢測。
　　 結(jié)果:1.經(jīng)PCR方法及Western blot鑒定,AdCMV-TK及AdCMV-IL-18構(gòu)建正確,并能在C6細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。2.重組腺病毒滴度的測定:AdCMV-

9、TK=1.28×109pfu/ml;.AdCMV-IL-18=1.28×109pfu/ml。3.腺病毒轉(zhuǎn)染效率的測定:隨著MOI的增加,腺病毒對C6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率增加,當(dāng)MOI為1、10、50、100和200時(shí)有3％、9％、65％、88％和100％的C6細(xì)胞可被腺病毒轉(zhuǎn)染,確定MOI=100為細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。4.HSV-TK和IL-18基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用及旁觀者效應(yīng)觀察:5天后IL-18組細(xì)胞存活率為(65.5±2.3)％,HS

10、V-TK/GCV組細(xì)胞存活率為(38.2±3.4)％,兩者聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞存活率降至(24.6±2.1)％,經(jīng)檢驗(yàn)顯示差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合治療組的旁觀者效應(yīng)顯著高于單獨(dú)的TK組或IL-18組,差異具有顯著性(P＜0.05)。5.動(dòng)物試驗(yàn):實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)TK及IL-18基因在腫瘤組織中有表達(dá):2周時(shí)對照組鼠腫瘤體積為163.5±27.6mm3,HSV-TK/GCV組、IL-18組、聯(lián)合治療組體積分別為57.2±13.5 m

11、m3,72.4±16.2 mm3,48.4±14.6 mm3,6周時(shí)HSV-TK/GcV組、IL-18組、聯(lián)合治療組分別為123.5±18.7 mm3,132.7±26.3 mm3,52.6±10.4 mm3,聯(lián)合治療組體積與其它組體積相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);聯(lián)合治療組與其它組生存期存在顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。6.HE染色示聯(lián)合組壞死明顯,免疫組化示聯(lián)合治療組腫瘤組織中有豐富的CD4+及CD8'淋巴細(xì)胞浸潤。