雄黃對大鼠C6膠質瘤細胞作用的實驗研究.pdf

1、目的：采用大鼠C6膠質瘤細胞系作為實驗對象，觀察雄黃對體外培養(yǎng)的C6膠質瘤細胞生長的作用，探討雄黃在體外引起腫瘤細胞生長抑制的作用機制；建立C6裸鼠膠質瘤皮下動物模型，通過局部給藥的方法，觀察雄黃對體內腫瘤的作用并對其機制進行初步探討。 方法： 1、C6膠質瘤細胞生長特性的觀察①培養(yǎng)條件：大鼠C6膠質瘤細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、含100U/L青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于飽和濕度、37℃、5％CO2的孵箱中。

2、 ②C6膠質瘤細胞的形態(tài)和生長情況的觀察：倒置相差顯微鏡觀察C6膠質瘤細胞的形態(tài)和生長情況，取對數(shù)生長期細胞，消化后以1 x 105/孔接種于3個六孔板，每個時間點設2個復孔，在接種后2h、4h、6h、8h、10h、12h取出，計算傳代后的細胞在各個時間點的貼壁率變化(每孔計數(shù)3次，取均值)。 ③生長曲線的繪制：采用MTT法測定細胞在96孔細胞培養(yǎng)板上的生長情況，以培養(yǎng)時間為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線：在24孔

3、細胞培養(yǎng)板上采用消化計數(shù)取多次平均值的方法測定細胞數(shù)目，繪制生長曲線，計算細胞倍增時間。 2、雄黃對C6膠質瘤細胞系作用的體外實驗①雄黃溶液的制備：按照參考文獻配制雄黃溶液，以原子吸收光譜法測定溶液中砷元素的含量以標定藥物濃度。 ②雄黃溶液工作濃度的確定：以MTT法測定雄黃對C6細胞生長的影響，具體步驟如下。 取對數(shù)生長期的細胞，加入雄黃溶液，調整最終反應濃度分別為5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg

4、/L，和100mg/L；以PBS為陰性對照組，與試驗孔平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，分別作用24、48小時，上酶標儀檢測，以空白對照孔調零，檢測570nm處的吸光度；以時間為橫軸，光吸收值(A570)為縱軸，繪制細胞生長曲線;以陰性對照組的吸光度為參照，計算細胞存活率及IC50(半數(shù)抑制濃度)。根據(jù)實驗結果，雄黃24小時和48小時的IC50均接近25mg/L，因此，我們選擇25mg/L作為雄黃的工作濃度。③超微結構變化的觀察：取

5、對數(shù)生長期C6細胞，常規(guī)消化傳代，24小時后加入雄黃溶液，調整濃度至25mg/L。分別作用于C6細胞24小時和48小時后，收集細胞，經(jīng)戊二醛固定后制作透射電鏡標本，在電鏡下觀察雄黃引起的細胞超微結構變化。 ④早期凋亡的觀察：取對數(shù)生長期細胞，傳代培養(yǎng)24小時后，加入雄黃溶液調整濃度至25mg/L，分別作用24和48小時后，以Annexin V-FITC-PI雙染法標記C6細胞，用流式細胞儀觀察其早期凋亡情況。 ⑤中晚期凋

6、亡的觀察：制備細胞爬片，以雄黃溶液分別作用于C6細胞24和48小時后，用TUNEL法標記DNA斷端，觀察雄黃引起的中晚期凋亡，在光鏡下計數(shù)陽性細胞，計算細胞凋亡指數(shù)。 ⑥Bax，Bcl-2和c-myc mRNA的表達：雄黃溶液作用C6細胞24和48小時后，收集細胞，常規(guī)提取總mRNA，以RT-PCR法檢測凋亡相關基因Bax，Bcl-2和癌基因c-myc mRNA的表達情況。 ⑦Bax，Bcl-2和c-myc蛋白的表達：雄

7、黃溶液作用于C6細胞24和48小時，常規(guī)提取總蛋白，以免疫印跡法(Western Blotting)檢測Bax，Bcl-2和c-myc蛋白的表達情況。 ⑧細胞增殖活性檢測：制備細胞爬片，應用免疫組織化學方法對雄黃溶液作用24和48小時后的C6膠質瘤細胞進行PCNA標記，觀察細胞的增殖活性變化。 3、雄黃抗C6膠質瘤的體內實驗①動物模型的建立和觀察：抽取含105個C6單細胞懸液接種于裸鼠臀部皮下，建立C6/Balb/c裸小

8、鼠皮下膠質瘤動物模型，每天測量腫瘤直徑，觀察腫瘤的生長情況，待腫瘤直徑達5mm時分組進入實驗。 ②藥物干預：裸鼠隨機分為無干預組、PBS陰性對照組和雄黃治療組。建模成功后，無干預組正常飼養(yǎng)，不予其他任何處理；PBS對照組和雄黃治療組采用局部注射的方法，分別將PBS和雄黃一次性注入動物瘤體內，觀察記錄腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線。治療后第11天處死動物，取腫瘤組織行進一步實驗。③腫瘤組織的鑒定：使用免疫組化法對所得組織進行GFA

9、P染色，檢測GFAP表達情況，確定其腫瘤膠質細胞來源。 ④形態(tài)學觀察：通過HE染色觀察腫瘤組織的顯微結構變化，電鏡下觀察實驗各組的腫瘤細胞超微結構變化。 ⑤用TUNEL，法檢測細胞凋亡情況：對照組和雄黃處理組腫瘤組織的石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后按照TUNEL試劑盒說明書進行標記、染色，光鏡下計數(shù)陽性細胞，計算凋亡指數(shù)。 ⑥腫瘤組織的Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表達情況的觀察：分別使用RT-PCR法和W

10、estern Blotting法檢測PBS組和雄黃治療組腫瘤組織Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表達情況。 4、統(tǒng)計分析： 使用SPSS for Windows 11.5進行統(tǒng)計分析。所有計量資料均以“x±s”的形式表示，根據(jù)實驗結果的情況(樣本數(shù)量、方差齊性、正態(tài)性檢驗)選擇適當?shù)臋z驗方法(t檢驗、方差分析或非參數(shù)檢驗)；計數(shù)資料的比較采用率的比較。 結果： 1、C6膠質瘤細胞的生長特性觀

11、察： ①我們所獲得C6膠質瘤細胞具備生長穩(wěn)定的特點，在一定培養(yǎng)階段能夠呈對數(shù)期生長。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞貼壁生長，呈梭形或三角形，大小均勻，排列緊密，折光性強，細胞膜光滑無突起，細胞核呈圓形，居中，核仁不明顯，細胞增殖活躍，核分裂相多見。2h、4h、6h、8h、10h、12h時的貼壁率分別為22％，70％，85％，87％，92％，97％，符合實驗要求。 ②以MTT法測定的細胞生長曲線，顯示按照4×103/孔的濃度種

12、植于96孔板、2×104/孔種植于24孔板均可獲得自接種24小時后開始連續(xù)3天的對數(shù)生長期，可以滿足實驗的要求。 2、雄黃抗C6膠質瘤的體外實驗結果①所配制的雄黃原溶液經(jīng)原子吸收光譜法測定砷濃度為1034mg/L。 ②按MTT結果顯示，各濃度的雄黃作用于C6細胞24、48小時后的抑制率與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)：作用24小時，臨近濃度組間(5mg/L與10mg/L組間，10mg/L、25mg/L和50

13、mg/L組間)的抑制率經(jīng)組內兩兩比較比較沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。而在48小時時，各濃度之間的抑制率差別增加，相鄰濃度組間差別有統(tǒng)計學意義。100mg/L組與其他各濃度組均有顯著性差異(P＜0.05)。曲線作圖后根據(jù)公式計算得24小時和48小時的IC50分別為28mg/L、26mg/L，(圖1-7)。 ③電鏡下觀察到發(fā)現(xiàn)，對照組細胞呈橢圓形，表面微絨毛正常，染色質在胞核內分布均勻，粗面內質網(wǎng)增生活躍；在雄黃作用24小時組可發(fā)現(xiàn)細胞凋亡

14、變化，如核固縮、染色質趨邊凝聚等；作用48小時可發(fā)現(xiàn)除上述改變外，少數(shù)細胞出現(xiàn)壞死改變。 ④Annexin V-FITC-PI雙染流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，雄黃作用于C6細胞可發(fā)現(xiàn)凋亡特征，24小時和48小時的凋亡率分別為10.13±3.14％和41.04±17.44％，二者比較有顯著性差異。 ⑤TUNEL結果顯示，雄黃作用24、48小時細胞的陽性率分別為8.7±1.83％和12.2±5.75％，二者比較有顯著性差異。

15、 ⑥RT-PCR結果：與對照組比較，雄黃溶液作用24小時后，c-mvc和Bcl-2 mRNA表達受抑，Bax mRNA的表達水平升高，在作用48小時更明顯，以上結果均有顯著性差異(P＜0.05)。 ⑦Western Blotting結果：與對照組相比，雄黃作用于C6細胞24小時能使Bcl-2和c-myc蛋白表達降低，并促進Bax蛋白表達水平，其作用在48小時更加明顯(P＜0.05)。 ⑧PCNA免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)25m

16、g/L的雄黃作用24和48小時的PCNA指數(shù)分別為76.6±11.2％和81.2±12.1％，與對照組比較無統(tǒng)計學差異。 3、雄黃抗C6膠質瘤的體內實驗結果。 4、結論 ①本實驗表明，雄黃對膠質瘤C6細胞有抑制作用，且具有濃度和時間依賴性。雄黃均可在體內外引起C6膠質瘤細胞生長抑制，其機制與細胞增殖活性無關。 ②初步的形態(tài)學觀察和凋亡檢測表明雄黃引起的腫瘤細胞生長抑制可能與細胞凋亡有關；雄黃誘導C6細胞凋