9L-rIL12-TK大鼠膠質(zhì)瘤基因免疫疫苗的安全可控性實驗研究.pdf

1、研究背景及目的: 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的40%～60%，尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤，具有遠(yuǎn)處侵襲性，惡性程度高，目前在神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)、影像診斷技術(shù)、放療化療等方面盡管取得了很大的進(jìn)步，但患者臨床治療效果仍不盡人意，治愈率低且易復(fù)發(fā)，死亡率高，其主要原因之一是患者自身抗腫瘤免疫功能低下，如何提高患者抗腫瘤免疫機(jī)能是膠質(zhì)瘤治療研究中的主要問題之一。隨著對腦膠質(zhì)瘤免疫學(xué)特性的深入研究和生物技術(shù)的發(fā)展，探索

2、各種膠質(zhì)瘤主動免疫疫苗成為生物免疫治療中關(guān)注的熱點。當(dāng)前，治療性腦膠質(zhì)瘤疫苗主要有以下幾類：一是樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）為基礎(chǔ)的疫苗，二是腫瘤細(xì)胞的瘤苗，三是基于病毒載體的溶瘤疫苗。其中腫瘤細(xì)胞疫苗是目前主要的研究方向。 本課題研究的是大鼠白介素-12基因（rIL-12）和人類I型單純皰疹病毒胸苷激酶自殺基因（HSV-TK）共同修飾大鼠膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞構(gòu)建的9L-rIL-12/TK可控性“活”細(xì)胞疫苗。此疫

3、苗細(xì)胞具有較完全的腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)，理論上具有提高免疫調(diào)節(jié)能力，同時更昔洛韋（GCV）對該疫苗具有殺傷作用，可以控制活疫苗的增殖，防止疫苗細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)增殖或種植轉(zhuǎn)移，在此殺傷過程中，可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤抗原的釋放和抗原提呈作用，進(jìn)而達(dá)到持續(xù)提高膠質(zhì)瘤的免疫原性，克服因血腦屏障帶來的免疫逃避，強(qiáng)化誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。關(guān)于本課題提出的可控制性膠質(zhì)瘤疫苗模式，目前在國內(nèi)尚未見類似報告。 本研究通過對現(xiàn)有9L-rIL12-TK細(xì)胞體外純化

4、抗性篩選，觀察其增殖情況，同時對其進(jìn)行GCV殺傷實驗，驗證HSV-TK/GCV系統(tǒng)的體外殺傷效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行裸鼠皮下細(xì)胞接種，觀察疫苗細(xì)胞的體內(nèi)成瘤情況并對其進(jìn)行GCV干預(yù)，對比干預(yù)前后活疫苗細(xì)胞成瘤變化，評估9L-rIL12-TK腦膠質(zhì)瘤基因免疫活細(xì)胞疫苗在體內(nèi)的安全可控性，為后續(xù)免疫研究打下基礎(chǔ)。 材料與方法: 1.實驗材料; 自主構(gòu)建基因修飾細(xì)胞（9L-rIL12-TK、9L-TK），9L大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)

5、胞；高糖型DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清FCS，含0．2%（m/V）EDTA的消化胰酶，更昔洛韋GCV，四甲基偶氮唑藍(lán)MTT，二甲基亞砜（DMSO），BSD，G418，臺盤藍(lán)，一次性耗材，BABL/C裸鼠（SPF）等。 2.實驗方法; 2．1,體外細(xì)胞實驗; 2．1．1,細(xì)胞增殖觀察抗性篩選細(xì)胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細(xì)胞24孔板培養(yǎng)，每日消化一組，計數(shù)細(xì)胞，連續(xù)5天，觀察細(xì)胞增值穩(wěn)定性； 2．

6、1．2,細(xì)胞GCV殺傷實驗抗性篩選細(xì)胞9L-rIL12-TK、9L-TK及9L細(xì)胞96孔板培養(yǎng)，次日更換0、5、10、20、40、80、160μg/ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況，第4天MTT法測細(xì)胞活力； 2．2,體內(nèi)細(xì)胞成瘤抑制實驗 2．2．1,裸鼠成瘤實驗40只裸鼠隨機(jī)分為3組，9L-rIL12-TK、9L-TK及9L組，相應(yīng)細(xì)胞右側(cè)腋下接種，1．2×106/只； 2．2．2,成瘤干預(yù)實驗第7天三

7、組裸鼠每組二次分GCV實驗組及生理鹽水對照組，次日開始干預(yù)，實驗組腹腔給予GCV抑瘤干預(yù)，對照組給予生理鹽水以行對照； 2．2．3,觀察途徑定時測量瘤徑，記錄裸鼠生存時間，實驗終止時取相應(yīng)標(biāo)本組織學(xué)檢查。 實驗結(jié)果: 1．1,24孔板培養(yǎng)觀察到抗性克隆細(xì)胞呈對數(shù)穩(wěn)定增殖，細(xì)胞的種類與各時間點的交互效應(yīng)有顯著性差異（F=4．220，P=0．003），不同細(xì)胞生長差異有顯著性意義（F=8．761，P=0．017），不

8、同時間點細(xì)胞有顯著性差異（F=2316．347，P=0．000），其中第4天各細(xì)胞有顯著差異（P=0．005），其余時間點各細(xì)胞間無顯著差異（P>0．05）； 1．2,通過含不同濃度的GCV的完全培養(yǎng)基96孔板細(xì)胞培養(yǎng)，MTT法檢測細(xì)胞活力，可見含帶TK基因的細(xì)胞活力與GCV的濃度呈負(fù)相關(guān)，不同濃度GCV與三種細(xì)胞活力的交互作用有顯著性差異（F=407．699，P=0．000），不同濃度的GCV對細(xì)胞活力的影響有顯著性差異（F=

9、2830．488，P=0．000），三種細(xì)胞對GCV敏感性有顯著性差異（F=6807．262，P=0．000），其中，在GCV濃度為10ug/ml時，9L-rIL12-TK及9L-TK細(xì)胞殺傷率分別為62．7%、50．93%，前者較后者敏感，差異顯著（P=0．000），而9L細(xì)胞基本不受影響，在濃度20-160ug/ml時，9L細(xì)胞和9L-TK、9L-rIL12-TK細(xì)胞間有顯著差異（均P=0．000），而9L-rIL12-TK細(xì)胞和9

10、L-TK細(xì)胞間無顯著性差異（均P>0．05），細(xì)胞基本完全被殺死，9L細(xì)胞僅有少量死亡； 2．1,疫苗細(xì)胞體內(nèi)成瘤抑制實驗9L-rIL12-TK疫苗細(xì)胞與9L-TK細(xì)胞、9L細(xì)胞接種裸鼠皮下，觀察到所有裸鼠在第7天均有成瘤，成瘤率100%，GCV干預(yù)后，9L-rIL12-TK、9L-TK實驗組裸鼠瘤體積均縮小，其余組瘤體繼續(xù)呈增大趨勢。取干預(yù)前后及實驗后期共四個時間點比較瘤體變化，不同時間點與不同組間裸鼠腫瘤體積增長的交互作用有

11、顯著性差異（F=47．004，P=0．000），不同時間點腫瘤體積增長有顯著性差異（F=316．600，P=0．000），不同組間裸鼠腫瘤體積增長有顯著性差異（F=60．442，P=0．000），其中干預(yù)開始即第9天不同組間腫瘤體積（200．025±38．46mm3）無顯著性差異（P=0．476），干預(yù)結(jié)束后即第18（273．61±256．47mm3）、27（1078．21±1287．79mm3）、36（4350．16±4289．69m

12、m3）天時，9L-rIL12-TK+GCV組和9L-rIL12-TK組比較差異均顯著（P=0．003、0．002、0．001），9L-TK+GCV組與9L-TK組差異也均顯著（P=0．004、0．001、0．006），9L實驗組和對照組比較差異不顯著（P>0．05），干預(yù)后不同時間點9L-rIL12-TK+GCV組和9L-TK+GCV組間無顯著性差異（P>0．05），裸鼠瘤體呈消退趨勢，其中9L-rIL12-TK+GCV組治療后細(xì)胞生長

13、受控（抑瘤率97．26%）較9L-TK+GCV組（抑瘤率82．52%）明顯，而9L組與9L+GCV組則無顯著差異（P>0．05），瘤體隨時間呈增大趨勢。60天時，腫瘤完全消退9L-rIL12-TK+GCV組有8只，復(fù)發(fā)率為0%，9L-TK+GCV組有3只腫瘤完全消退，5只縮小后再次增大，復(fù)發(fā)率62．5%。荷瘤裸鼠生存時間均受影響，9L+GCV組與9L組間無顯著性差異（LogRankX2=0．392，P=0．531），而9L-rIL12-

14、TK、9L-TK實驗組與相應(yīng)對照組間均有顯著差異（LogRankX2=15．782，LogRankX2=15．665，均P=0．000），裸鼠腫瘤消退或生長減慢，動物生存時間延長，尤其9L-rIL12-TK實驗組裸鼠完全無瘤生存。 2．2,裸鼠無瘤接種部位、瘤體及全身相關(guān)臟器取材，大體觀察，含帶rIL-12基因細(xì)胞的裸鼠脾臟顯著增大，9L-IK實驗組后期瘤結(jié)節(jié)中有大量液化壞死；組織學(xué)（蘇木精-伊紅染色HE）鏡下檢查，無瘤接種部位

15、無發(fā)現(xiàn)異性腫瘤細(xì)胞，瘤體中異型性細(xì)胞明顯，不含帶rIL-12基因的細(xì)胞瘤結(jié)節(jié)中血管豐富，而帶rIL-12基因的裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞增多；所有裸鼠全身臟器病理學(xué)檢查均未見腫瘤遠(yuǎn)處組織學(xué)轉(zhuǎn)移征象。 實驗結(jié)論: （1）基因修飾后的9L-rIL12-TK細(xì)胞體外增殖穩(wěn)定，對GCV殺傷效應(yīng)敏感，表明TK基因在疫苗細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定表達(dá)； （2）9L-rIL12-TK細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)可成瘤，但能夠被GCV抑制消除； （3）9L-

16、rIL12-TK細(xì)胞與9L-TK細(xì)胞均在裸鼠體內(nèi)成瘤，但GCV的抑瘤效果9L-rIL12-TK實驗組明顯優(yōu)于9L-TK實驗組，表明rIL-12參與調(diào)節(jié)，從而提高消瘤效果； （4）9L-rIL12-TK組裸鼠脾臟顯著增大，組織學(xué)檢查淋巴細(xì)胞增多，提示rIL-12可能參與調(diào)節(jié)體液免疫，其機(jī)理有待進(jìn)一步實驗研究； （5）9L-rIL12-TK細(xì)胞僅在局部成瘤，未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移征象。 上述結(jié)論表明，9L-rIL12-TK細(xì)胞