RPL8基因修飾的DC疫苗抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 1構(gòu)建RPL8基因的重組腺病毒載體和空載體腺病毒，獲得高滴度的腺病毒顆粒。
　　 2將RPL8腺病毒顆粒體外轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞(DC)，制成表達(dá)RPL8的DC疫苗。
　　 3采用MTT比色法檢測(cè)RPL8基因修飾的DC疫苗刺激同種T淋巴細(xì)胞對(duì)GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異的殺傷率。
　　 4將RPL8基因修飾的DC疫苗注入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的抗腫瘤作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：

2、
　　 1大量培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，按照總RNA試劑盒提取細(xì)胞RNA，以總RNA為模板，用RT-PCR方法克隆目的基因RPL8，與載體連接、酶切、插入，并轉(zhuǎn)移到pAdxsi腺病毒骨架載體上，包裝擴(kuò)增成腺病毒顆粒。
　　 2用重組腺病毒(pAdxsi-EGFP-RPL8)及空病毒Ad-EGFP(作為陰性對(duì)照)以實(shí)驗(yàn)室最佳的感染復(fù)數(shù)(MOI)150感染小鼠樹突狀細(xì)胞，于感染后24h、48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EG

3、FP)的表達(dá)情況，并應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)DC中有無(wú)RPL8 mRNA的表達(dá)。
　　 3重組RPL8的病毒顆粒(及空病毒)轉(zhuǎn)染DC，培養(yǎng)48h后與尼龍毛柱分離的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞按不同的比例混勻，繼續(xù)培養(yǎng)72h，分別以不同效靶比加入到GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞中培養(yǎng)48h，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。
　　 4將RPL8基因修飾的DC疫苗注入荷瘤小鼠體內(nèi)，進(jìn)行免疫治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤的體積變化及小鼠的生存時(shí)間與瘤體組織的病理變化

4、。
　　 結(jié)果：
　　 1經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了攜帶RPL8基因的重組腺病毒載體，并制備出高滴度(1.6×1010PFU/ml)的重組腺病毒和空載體腺病毒(1.0×1010PFU/ml)。
　　 2不同時(shí)間在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)，并用RT-PCR的方法檢測(cè)出DC細(xì)胞中有RPL8mRNA的表達(dá)，得到預(yù)期309bp的條帶。
　　 3 RPL8基因修飾的DC疫苗體外殺傷GL26