HOTAIR調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：
　　人腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤的侵襲和復(fù)發(fā)率都明顯高于顱內(nèi)其他腫瘤。特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）預(yù)后差、易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者生活和生存質(zhì)量，其中GBM患者中位生存期在1年左右。在當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的指導(dǎo)下，傳統(tǒng)的腫瘤分型正逐步轉(zhuǎn)向以分子遺傳特征為基礎(chǔ)的新診斷體系。癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas, TCGA）研究結(jié)果表明，包括表皮生長因子

2、受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）、β-連環(huán)素（β-catenin）、非編碼RNA HOTAIR為代表的多個癌基因突變、擴增是人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的重要分子事件。當(dāng)前觀點認(rèn)為，Wnt/β-catenin等在內(nèi)的多個信號通路與EGFR信號通路之間的協(xié)同作用和交互調(diào)節(jié)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤向快速生長期轉(zhuǎn)變，也是惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的重要原因。因此，尋找膠質(zhì)瘤中EGFRwt/vIII與β-catenin信號

3、通路調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因及其分子機制，成為影響膠質(zhì)瘤靶向治療效果關(guān)鍵所在。
　　方法：
　　1、對中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃（Chinese Glioma Genome Atlas, CGGA）和TCGA提供的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本全基因組測序數(shù)據(jù)分析HOTAIR表達(dá)；收集整理CGGA提供膠質(zhì)瘤標(biāo)本的性別、KPS評分等數(shù)據(jù)；隨訪CGGA生存期；焦磷酸測序法檢測CGGA所有標(biāo)本中異檸檬酸脫氫酶同工酶1（IDH1）和甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGM

4、T）突變頻率；免疫組織化學(xué)染色化學(xué)染色法檢測MGMT、人增殖細(xì)胞核核抗原（Ki-67）、EGFR、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）表達(dá)；Cox回歸分析HOTAIR表達(dá)與膠質(zhì)瘤標(biāo)本臨床特征關(guān)系。
　　2、U87人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)表達(dá)HOTAIR干擾RNA的慢病毒載體（Lenti-HOTAIR si）侵染48h后，提取總RNA，使用Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)進行測序，篩選差異表達(dá)基因。

5、篩選Nemo樣激酶（Nemo-like kinase, NLK）作為HOTAIR靶基因。
　　3、Lenti-HOTAIR si轉(zhuǎn)染U87和U87vIII細(xì)胞，蛋白印跡（Westernblot）檢測Nemo樣激酶（Nemo-like kinase, NLK）表達(dá)；染色體免疫共沉淀法檢測免疫共沉淀法檢測HOTAIR調(diào)控NLK轉(zhuǎn)錄；免疫共沉淀PKM2與β-catenin相互作用；熒光素酶實驗檢測β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性變化；

6、流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低HOTAIR后GBM細(xì)胞周期變化；克隆形成實驗、transwell實驗和劃痕實驗檢測GBM侵襲、遷移能力變化；WB檢測細(xì)胞周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　　4、建立不同HOTAIR表達(dá)水平的U87和U87vIII GBM裸鼠顱內(nèi)模型，使用小動物成像系統(tǒng)檢測腫瘤大??；HE染色檢測腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組化檢測Ki-67、NLK、p21等蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、通過對CGGA中310例

7、膠質(zhì)瘤和5例正常腦組織標(biāo)本中HOTAIR表達(dá)狀態(tài)的分析顯示，HOTAIR在GBM中表達(dá)高于低級別膠質(zhì)瘤（low grade glioma, LGG）和正常腦組織（P<0.05）；Kaplan-Meier生存分析顯示HOTAIR高表達(dá)GBM患者生存較差（P<0.05）；單因素回歸分析提示HOTAIR表達(dá)與患者確診年齡、MGMT啟動子甲基化相關(guān)（P<0.05）；與性別、KPS評分、是否完整切除、MGMT、PTEN、Ki67表達(dá)無關(guān)（P>0.

8、05）。多因素COX回歸分析提示HOTAIR表達(dá)、確診年齡、IDH1突變、KPS評分和Ki67表達(dá)等與GBM患者總生存負(fù)相關(guān)（P<0.05）。
　　2、通過對比是否轉(zhuǎn)染Lenti-HOTAIR si的U87MG細(xì)胞RNA測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)1288個過表達(dá)基因和1628個低表達(dá)基因。通過比對CGGA數(shù)據(jù)庫，初步鑒定NLK是HOTAIR下游候選靶基因。NLK表達(dá)在高級膠質(zhì)瘤（high grade glioma, HGG）中表達(dá)較LGG

9、降低（P<0.05）；就CGGA數(shù)據(jù)庫中GBM標(biāo)本中HOTAIR與NLK表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=0.156, P<0.05）。Western blot證實，敲低HOTAIR表達(dá)后，NLK表達(dá)升高；CHIP-PCR證實，H3K27me3在NLK5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和轉(zhuǎn)錄起始位點上游3kb范圍內(nèi)有結(jié)合位點，HOTAIR抑制NLK轉(zhuǎn)錄。
　　3、敲低U87MG和U87vIIIMG細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)后， TOP-FOP熒光素酶實驗證實，

10、β-catenin轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)（P<0.05）；總β-catenin（-p）和組分蛋白β-catenin（-p）表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；細(xì)胞周期阻滯于G1期；RB（-p）、p21和p16表達(dá)升高；CyclinD1、E2F1表達(dá)降低（P<0.05）；2-D基質(zhì)生長實驗示GBM細(xì)胞敲低HOTAIR細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)、增殖能力下降（P<0.05）；Transwell和劃痕實驗證實敲低HOTAIR后GBM細(xì)胞侵襲、遷移能力下降（P<0.05）

11、；Western blott提示E-cadherin表達(dá)升高；N-cadherin、NF-κB、ZEB-1、Twist-1表達(dá)下降（P<0.05）。
　　4、動物實驗結(jié)果提示，敲低HOTAIR表達(dá)的U87MG和U87vIIIMG裸鼠顱內(nèi)生存期高于對照組（P<0.05）；小動物成像和HE染色提示Lenti-HOTAIR si轉(zhuǎn)染組腫瘤體積小于對照組（P<0.05）；IHC檢測提示：敲低HOTAIR表達(dá)后， NLK和p21表達(dá)升高；K

12、i67、β-catenin、Slug表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，本研究首次鑒定膠質(zhì)瘤中非編碼RNA HOTAIR下游靶基因，且初步闡述膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與調(diào)控β-catenin信號通路的生物學(xué)功能以及作為治療靶點前的前景。具有以下三個重要的理論方法和實踐意義：（1）首次應(yīng)用通過對比CGGA數(shù)據(jù)庫和體外細(xì)胞系中RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出候選靶基因；為今后開展針對LncRNA的基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)依據(jù)；（2）通過基于